死亡相关蛋白(DAP5)对顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制研究

摘要

目的：顺铂(cisplatin,DDP)是当前肿瘤联合化疗中最常用的药物之一。由于可造成急性肾小管损伤而限制了其临床应用,其中肾小管上皮细胞凋亡是顺铂引起急性肾小管细胞损伤的主要机制之一。死亡相关蛋白(DeathAssociated Protein,DAP5)作为调控蛋白质翻译的重要因子,在应激或凋亡等经典蛋白质翻译途径被抑制的情况下,DAP5可通过内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site,IRES)途径来促进某些蛋白质翻译表达,以维持细胞的正常生存。但是DAP5在顺铂引起急性肾小管损伤过程中具体机制还不清楚。本研究在体内和体外建立顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡模型的基础上,观察DAP5在顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡过程中的表达变化,研究DAP5对细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响,探讨DAP5在顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的具体调控机针。进而研究DAP5是否受调控蛋白翻译的重要信号通路(PBK/Akt/mToR)的影响,为临床防护顺铂引起的急性肾损伤提供新的方法。
　　 方法：⑴顺铂诱导急性肾小管上皮细胞凋亡体内与体外模型的建立:对青年Wistar大鼠腹腔注射顺铂72h后,建立体内肾小管细胞凋亡模型,利用肾功能指标和肾组织病理评分对肾脏损伤程度进行评估,TUNEL染色检测细胞凋亡,western blot方法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相关指标的变化情况；应用不同浓度梯度的顺铂对人肾小管上皮细胞(HK(C)刺激24h后建立体外模型,应用细胞核Hocbtest染色及流式细胞仪对凋亡细胞进行检测,western blot方法验证上述凋亡相关指标的蛋白质表达变化。⑵DAP5调控顺铂诱导的HKC细胞凋亡的作用。通过质粒转染和siRNA干扰技术过表达及下调HKC细胞内的DAP5表达,在此基础上观察对顺铂诱导这两种HKC细胞凋亡的影响,应用流式细胞仪检测细胞凋亡程度,western blot检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白水平的表达,探讨DAP5在顺铂诱导HKC细胞凋亡中的具体作用机制。检测顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡过程中PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化,并应用triciribine(Akt特异性抑制荆)和rapamycin(mToR特异性抑制剂)阻断该信号通路后,用western blot检测对DAP5表达变化的影响,探讨PI3K/Akt/mTOR通路与DAP5的相互关系。
　　 结果：大鼠经腹腔注射顺铂72h后,发生急性肾损伤,血肌酐及尿素氮明显增高。病理组织学显示近端肾小管上皮细胞损伤,出现空泡样变性和颗粒样变性,近端肾小管扩张,肾小管腔中可见蛋白质管型。小管刷状缘脱落,细胞排列紊乱。肾小管上皮细胞经TUNEL染色后阳性率明显增加。应用western blot对caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bcl-2、Bax凋亡相关指标进行检测,发现caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表达水平在模型组中较对照组明显增高,Bcl-2则较对照组明显下降。在体外应用不同浓度的顺铂(1～100μM)作用于HKC细胞24h后,采用Hochest染色和流式细胞仪检测发现细胞凋亡随顺铂浓度的增加而增加。对体外实验的凋亡相关指标进行检测,结果与体内实验的变化一致,caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表达水平随顺铂浓度的增高而增加,而Bcl-2则随之下降。同时,在顺铂诱导的HKC细胞凋亡过程中,可见DAP5裂解生成86KDa片段的蛋白质-DAP5/p86。经质粒转染后过表达DAP5/p97和DAP5/p86后均可使Bcl-2的表达增加,并可减轻顺铂诱导的细胞凋亡；而利用siRNA负向调控DAP5则可使Bcl-2表达下降,并导致细胞凋亡增加。过表达或负向调控DAP5均对Bax的表达无影响。进而在顺铂诱导的凋亡过程中对PI3K/AKT/mTOR信号通路进行了检测,可见PI3K、p-Akt和p-mTOR表达下调,提示该信号通路被抑制,应用triciribine和rapamycin阻断PI3K/Akt/mTOR通路后可见DAP5表达下降,Bcl-2和Bax表达降低。因而发现DAP5受PI3K/Akt/mTOR通路的正向调控。
　　 结论：本实验成功建立了顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡的体内与体外模型,首次对DAP5在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制进行了研究,发现在肾小管上皮细胞凋亡过程中DAP5可裂解为86KDa的蛋白片段DAP5/p86,全长DAP5/p97与裂解后DAP5/p86均可促进抗凋亡基因Bcl-2的翻译表达,发挥抑制凋亡的作用。同时负向调控DAP5也可使Bcl-2表达下降。PI3K/Akt/mTOR通路可正向调控DAP5。本实验通过过表达DAP5减轻顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡,为预防和治疗顺铂的肾毒性提供了新的研究思路。