胰岛素对2型糖尿病大鼠下颌骨组织蛋白表达的影响及相关机制的初步研究

摘要

人工种植技术已经被广泛地应用到牙齿缺失、颌骨缺损等多个方面，成为一种成熟可靠的修复方法。但对于糖尿病患者的人工种植体存在风险，临床调查研究显示，糖尿病患者的种植1年成功率约为84.3-90％，要明显低于非糖尿病患者的95%。
　　糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，分为1型和2型，糖尿病患者中有90%为2型糖尿病，并且其发病率逐年升高。研究已证实，2型糖尿病会导致人或者动物模型的骨组织钙磷流失，骨代谢异常，以及骨结构和骨质量发生改变。种植体骨整合是人工种植体修复成功的基础，而2型糖尿病导致种植体周围骨形成减少、骨愈合不良以及组织愈合延迟。动物实验同样证实糖尿病大鼠种植体周围骨形成障碍，骨形成过程中的关键因子低于正常活性表现。
　　骨形成是一个复杂的过程，成骨发生的关键是骨髓基质细胞向骨形成转变，分化为成骨细胞，继而成骨细胞分化，完成细胞外基质的合成、沉积和矿化。研究证实，高糖环境下骨髓基质细胞成骨分化能力减弱，成骨细胞的增殖和矿化能力也减弱，这些都被认为是糖尿病导致骨质下降的原因，但其机制尚不清楚。
　　胰岛素是一种重要的细胞代谢调节激素，是目前控制血糖的有效药物。胰岛素能促进细胞的生长和分化，尤其是对骨代谢相关细胞的作用受到广泛关注。研究证实，胰岛素可通过直接或间接作用促进成骨合成，预防骨流失，从而提高骨密度和骨强度，因此，胰岛素的应用可以改善2型糖尿病对骨质的影响，但其影响机制尚不清楚。
　　蛋白质组学已经广泛应用于研究某种疾病全蛋白的定性和定量表达，被视为一种强大的研究疾病相关蛋白的方法，其可为不同的细胞、组织和生物过程提供参考图和数据库。蛋白质组学已经应用于糖尿病及骨组织的研究，但迄今为止，对于胰岛素及2型糖尿病对下颌骨中全蛋白的影响未见报道，应用蛋白质组学研究有助于探讨2型糖尿病对颌骨的影响机制，以及胰岛素改善2型糖尿病对颌骨影响的机制。
　　第一部分胰岛素对2型糖尿病大鼠下颌骨组织蛋白表达的蛋白质组学研究
　　目的：探讨2型糖尿病大鼠与正常大鼠下颌骨组织表达的蛋白差异以及胰岛素对差异蛋白的影响。内容：对正常大鼠（Wistar大鼠）、2型糖尿病大鼠（Goto-Kakizaki大鼠）以及给予胰岛素（Insulin）治疗2周的糖尿病大鼠的下颌骨组织进行蛋白质组学分析。根据结果筛选出受胰岛素调控的蛋白，进一步应用Q-PCR检测受调控蛋白的mRNA在正常大鼠、糖尿病大鼠、以及胰岛素分别治疗2周和4周的糖尿病大鼠下颌骨组织中的表达。结果：经过双向凝胶电泳及MALDI-TOF/TOF质谱分析，成功鉴定Wistar大鼠和GK大鼠下颌骨组织间差异显著的蛋白点36个，主要分属于6大功能：代谢、蛋白结合、细胞支架、细胞外基质蛋白、信号转导、免疫应答。其中10个蛋白的表达显著受胰岛素的调控。Q-PCR结果显示，胰岛素可改善10个差异蛋白mRNA在GK大鼠颌骨组织中的表达，且给予4周胰岛素治疗的作用显著。结论：蛋白质组学发现2型糖尿病大鼠同正常大鼠下颌骨表达的差异蛋白，可作为研究2型糖尿病对颌骨代谢影响的新靶点。
　　第二部分胰岛素对高糖环境下prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中表达的影响
　　目的：探讨高糖环境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中的表达及胰岛素对其表达的影响。方法：从Wistar大鼠下颌骨中分离培养骨髓基质细胞。MTT法检测在不同葡萄糖浓度(5.5、25、45mM)及不同胰岛素浓度（0，10-7，10-6和10-5M）培养骨髓基质细胞1、3、5、7、10d，细胞的增殖情况；将细胞分别于不同糖浓度下（5.5、25、45mM）及胰岛素(0、10-5mol/L)的干预下成骨诱导。矿化21d，茜素红染色，矿化定量分析，观察对细胞矿化的影响。矿化诱导1、3、7、14、21d，ELISA试剂盒检测prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表达。结果：①与5.5mM糖浓度相比，25mM高糖环境中rBMSC的增殖活性增强，45mM高糖环境中rBMSC的增殖活性显著下降；②10-5M胰岛素可显著提高rBMSC在三种糖浓度中的增殖活性；③与5.5mM糖浓度相比，25mM组可见少量散在的矿化基质，但45mM组未见明显的矿化结节，胰岛素可改善高糖环境下rBMSC钙结节的形成；④高糖环境下，prohibitin和peroxiredoxin-6在rBMSC成骨分化表达下降，45mM组蛋白下降尤为显著，10-5M胰岛素可上调高糖环境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表达；⑤Prohibitin蛋白在rBMSC成骨分化的第3d表达显著，peroxiredoxin-6蛋白则在rBMSC成骨分化第21d表达显著。结论：高糖环境抑制rBMSC的增殖和矿化，胰岛素可改善这种抑制作用。Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白分别在rBMSC成骨分化早期和后期起到重要作用。高糖环境对prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在rBMSC成骨分化过程中的表达有抑制作用，胰岛素可改善高糖的抑制作用。
　　第三部分胰岛素对高糖环境下prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨细胞（ROS17/2.8）分化过程中表达的影响
　　目的：探讨高糖环境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠成骨细胞分化过程中的表达变化及胰岛素对其表达的影响。方法：将大鼠成骨细胞（ROS17/2.8）在不同葡萄糖浓度(5.5、25、45mM)的培养基中培养，加入不同浓度胰岛素（0，10-7，10-6和10-5M）培养1、3、5、7、10d，MTT法检测细胞增殖；将细胞分别于不同糖浓度下（5.5、25、45mM）及胰岛素(0、10-6mol/L)的干预下培养1、3、7、14、21d，ELISA试剂盒检测prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表达。矿化21d，茜素红染色，矿化定量分析，观察对细胞矿化的影响。结果：①与5.5mM糖浓度相比，25mM高糖环境中大鼠成骨细胞的增殖活性增强，45mM高糖环境中细胞增殖活性显著下降；②10-6M胰岛素可显著提高成骨细胞在三种糖浓度中的增殖活性；③与5.5mM糖浓度相比，25mM组钙结节较少，45mM组未见明显的矿化结节，胰岛素可改善细胞矿化情况；④高糖环境下prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨细胞中的表达下降，45mM组蛋白下降更为显著，10-6M胰岛素可上调高糖环境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表达；⑤Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白均在成骨细胞分化第21d表达显著，均在第7d开始显著下降。结论：高糖环境抑制成骨细胞的增殖和矿化，胰岛素可改善这种抑制作用。高糖环境对prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在成骨细胞分化过程中的表达有抑制作用，且抑制作用始于细胞外基质形成初期，胰岛素可改善高糖的抑制作用。

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前言

第一部分 胰岛素对2型糖尿病大鼠下颌骨组织蛋白表达的蛋白质组学研究

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 胰岛素对高糖环境下Prohibitin和Peroxiredoxin-6在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中表达的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 胰岛素对高糖环境下Prohibitin和Peroxiredoxin-6在大鼠成骨细胞分化过程中表达的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述一

参考文献

综述二

参考文献

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