成纤维细胞生长因子-18上调动脉壁弹力纤维表达的体外试验研究

摘要

目的:
　　构建携载人成纤维细胞生长因子－18的慢病毒，并感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和股动脉平滑肌细胞(HASMC)，研究该因子过表达状态下，对这两种细胞合成弹力纤维的影响效应，为下一步体内试验研究FGF-18重建主动脉壁弹力纤维的效果初探方向。
　　方法:
　　1.构建携载人FGF-18基因并有flag和GFP标签的慢病毒载体质粒，通过293T细胞进行慢病毒包装，并将包装后病毒感染293T细胞，通过观察细胞荧光表达，和检测FGF-18蛋白表达量，验证该慢病毒包装效果；
　　2.通过免疫细胞化学染色技术鉴定FGFR-2在HUVEC和HASMC中的表达情况；
　　3.以不同MOI值的慢病毒分别感染HUVEC和HASMC，确定两种细胞慢病毒感染的最佳MOI值，对感染效率不佳的细胞通过流式细胞仪进行筛选；
　　4.两种细胞各设立实验组、空载体对照组和空白对照组，通过real-time PCR、Elisa法及western-blot法检测各组细胞FGF-18、FGF受体-2(FGFR-2)、弹力蛋白原(elastin)、微纤维蛋白-1(fibrillin-1)及fibulin-5在mRNA水平和蛋白水平的表达量，通过激光共聚焦显像技术观察各组弹力纤维含量的差异，最终采用MTT法评价各组细胞增殖状态的差异。
　　结果:
　　1.经PCR检测和测序鉴定，成功构建携载人FGF-18基因的慢病毒载体质粒，经293T细胞包装后所得慢病毒滴度为3.45×108IU/ml；
　　2.Lentivirus-FGF-18感染293T细胞后，观察到明显的荧光表达，且MOI=10时检测到FGF-18蛋白高表达；
　　3.HUVEC的细胞膜和胞核上可见FGFR-2的阳性染色，HASMC在细胞膜上可观察到FGFR-2的阳性染色；
　　4.HUVECM最佳MOI值为20，而HASMC以MOI=160感染时，实验组与空载体对照组荧光表达率均低于30％，经流式细胞仪筛选后，两组荧光表达率均达90％以上；
　　5.经real-time PCR检测，HUVEC实验组中FGF-18、FGFR-2、elastin的mRNA较其他两组有明显增高(P<0.05)，fibulin-5和fibrillin-1的mRNA三组间无明显差异(P>0.05)；HASMC实验组中仅FGF-18和FGFR-2的mRNA较其他两组有明显增高(P<0.05)，而elastin和fibrillin-1的mRNA三组间无明显差异(P>0.05)；
　　6.经Elisa法检测，HUVEC实验组FGF-18表达量较其他两组高，而HASMC实验组未发现FGF-18高表达；
　　7.经western-blot检测，HUVEC实验组的fibulin-5较其他两组有高表达趋势，三组间elastin无明显表达量差异；HASMC实验组elastin和fibulin-5的表达量较其他两组反而减少；
　　8.通过激光共聚焦显像技术观察到，HUVEC实验组中弹力纤维的荧光染色量较空载体对照组有明显提高，而HASMC的实验组未有明显阳性结果；
　　9.MTT法检测到HUVEC和HASMC实验组的OD值较空载体对照组均明显增高(P<0.05)。
　　结论:
　　1.采用三质粒包装系统能够成功完成lentivirus-FGF-18的包装；
　　2.HUVEC和HASMC至少在细胞膜表面存在FGFR-2：
　　3.lentivirus-FGF-18感染HUVEC和HASMC后，两种细胞的FGF-18在mRNA水平过表达；
　　4.FGF-18能够促进HUVEC合成弹力蛋白和fibulin-5，并能够促进其增殖；
　　5.尚不能认为FGF-18对平滑肌细胞合成弹力纤维有促进作用。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

课题总体设计

第一部分 人成纤维细胞生长因子-18基因慢病毒表达载体的构建

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

第二部分 人FGF-18慢病毒载体体外感染人血管平滑肌细胞和内皮细胞的作用研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

展望

附图

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表文章情况

致谢