长链非编码RNA-TSLC1-AS1在人脑胶质瘤中的表达及功能研究

摘要

脑胶质瘤约占原发性颅内肿瘤的40％~50%,是中枢神经系统中最常见的肿瘤。传统的治疗手段包括手术治疗,放疗和化疗。但由于胶质瘤呈浸润性生长,肿瘤组织与周围正常脑组织界限不清,手术难以全切,效果不佳,且术后易复发。放疗和化疗常作为术后的辅助手段,不能特异的杀伤肿瘤细胞,同时还可能产生中枢神经系统的毒副作用,因而脑胶质瘤的治疗是神经外科研究的难点之一。探索胶质瘤治疗的新途径,尤其是从基因水平阐明胶质瘤的发生、发展和演变机理,寻找有效的基因治疗的靶点是近年来神经外科研究的的热点。
　　长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸同时不编码蛋白质的RNA。研究表明lncRNA可在表观遗传学,转录及转录后水平调控基因的表达,调控的方式包括染色体修饰,转录激活或干扰等。lncRNA与肿瘤存在密切的关系,一些lncRNA在正常组织与肿瘤组织中的表达存在显著的差异性,异常的lncRNA可能在肿瘤的发生中起重要作用,有理由预测lncRNA可能成为肿瘤诊断和判断预后以及治疗效果的一个新的标志物,同时lncRNA可以成为一个新的肿瘤基因治疗的靶点。
　　目前关于lncRNA在中枢神经系统肿瘤中的报道甚少。许多研究表明,蛋白编码基因TSLC1为肿瘤抑制基因,通常在许多肿瘤中被甲基化下调,包括神经胶质瘤,神经母细胞瘤,肺癌,鼻咽肿瘤,恶性黑色素瘤,食管癌,肝癌,乳腺癌,胃癌,胰腺癌,大肠癌,子宫颈癌和前列腺癌。而TSLC1的反义转录本TSLC1-AS1作为lncRNA家族成员之一,在脑胶质瘤中的表达及对胶质瘤发生、发展的作用尚未见报道。
　　本研究采用定量PCR方法检测了30例脑胶质瘤组织、正常脑组织及人脑胶质瘤细胞系U87,U251,SNB19中lncRNA-TSLC1-AS1和mRNA-TSLC1的表达情况,研究TSLC1-AS1在脑胶质瘤组织与正常脑组织中表达的差异性,在不同级别脑胶质瘤中表达的差异性,及其与TSLC1表达的相关性。结果发现与正常脑组织相比,TSLC1-AS1和TSLC1在肿瘤组织中的表达水平明显下调(P<0.05)。在病理分级较高的脑胶质瘤组织中,TSLC1-AS1和 TSLC1的表达水平明显低于在病理分级较低的脑胶质瘤组织中的表达水平(P<0.05)。TSLC1-AS1的表达与TSLC1的表达呈正相关(R=0.66,P<0.01)。上述结果提示TSLC1-AS1在人脑胶质瘤细胞中的表达水平显著降低,其表达水平随脑胶质瘤恶性程度的增高而降低,可作为脑胶质瘤诊断,临床分级及判断预后的分子指标。
　　在此基础上构建了TSLC1-AS1表达载体pcDNA-TSLC1-AS1,利用其转染U87细胞株,获得高表达TSLC1-AS1的U87细胞;应用MTS分析法检测TSLC1-AS1表达升高对U87细胞增殖的影响。应用Transwell实验检测TSLC1-AS1表达升高对U87细胞迁移能力的影响。结果发现转染了pcDNA-TSLC1-AS1的U87细胞系中TSLC1-AS1的表达上调,明显高于pcDNA control对照组(P<0.05),同时TSLC1的表达也明显上调,高于pcDNA control对照组(P<0.05)。转染pcDNA-TSLC1-AS1后24,48,72,96小时,U87细胞增殖率显著低于对照组(P<0.05)。迁移度与对照组相比显著减少(P<0.05)。此后,我们利用TSLC1-AS1 siRNA质粒转染SNB19细胞株,获得低表达TSLC1-AS1的SNB19,进一步验证了TSLC1-AS1表达变化对胶质瘤细胞增殖与迁移能力的影响。
　　结果发现转染了双链TSLC1-AS1-siRNA1及TSLC1-AS1-siRNA2的SNB-19细胞系中TSLC1-AS1的表达明显下调,在TSLC1-AS1-siRNA1干扰组中,TSLC1-AS1的表达下调约90%,明显低于对照组(P<0.05),同时TSLC1的表达也明显下调,低于对照组(P<0.05)。在转染了TSLC1-AS1-siRNA1正义链的SNB-19细胞系中TSLC1-AS1和TSLC1的表达明显下调,低于对照组(P<0.05)。而在转染了TSLC1-AS1-siRNA1反义链的SNB-19细胞系中,TSLC1的表达却未见明显下调(P>0.05)。该结果排除了TSLC1-AS1-siRNA1反义链对TSLC1的表达下调的脱靶效应,进一步确认了在SNB-19细胞系中下调TSLC1-AS1的表达可下调TSLC1的表达。用MTS法检测转染TSLC1-AS1-siRNA1及TSLC1-AS1-siRNA2后人脑胶质瘤细胞株SNB19的增殖能力,转染TSLC1-AS1后24,48,72,96小时,SNB19细胞增殖率显著高于对照组(P<0.05)。此外Transwell实验进一步证实TSLC1-AS1表达降低可以显著提高SNB19细胞的迁移能力(P<0.05)。上述结果表明上调TSLC1-AS1在胶质瘤中的表达可同时上调TSLC1的表达,抑制肿瘤的增殖、迁移能力,反之亦然。该研究为脑胶质瘤的靶向治疗提供了理论依据。

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前言

参考文献

第一部分TSLC1-AS1在人脑胶质瘤中的表达的研究

材料和方法

一、实验材料

二.方法：

结果

第二部分 上调TSLC1-AS1的表达对胶质瘤细胞系U87生物学特性影响的研究

材料与方法

一.实验材料：

二.方法：

结果

第三部分 应用siRNA干扰下调TSLC1-AS1的表达对胶质瘤细胞SNB19生物学特性影响的研究

材料与方法

一.实验材料：

二.方法：

结果

讨论

参考文献

综述：

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