GCRG213蛋白在人胃粘膜组织中的表达特征及其量子点免疫荧光双色标记检测

摘要

背景:
　　胃癌相关基因213(Gastric Cancer Related Gene213, GCRG213)是有功能的人长散在核元件中核酸内切酶(long interspersed nuclear element-1 endonuclease, LINE-1 EN)的变异体。前期研究发现GCRG213可能在胃癌的发生发展中发挥着重要作用。免疫组织化学分析显示,GCRG213蛋白在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,而在胃癌手术切除标本切缘的非癌变组织中,其粘膜层的被覆上皮呈阴性表达。 GCRG213蛋白在人正常胃粘膜组织中各种腺体的表达特征尚未见报道。
　　量子点(Quantum Dots,QDs)是一种新型纳米材料。与传统的有机染料相比,量子点具有优良的荧光性质,主要表现:激发光谱宽,而且呈连续分布;发射光谱窄,呈对称分布;抗光漂白能力强;大小不同的量子点可以在单一激发光源下同时产生不同颜色的荧光,且几乎没有重叠。基于这些优良特性,量子点可以作为一种荧光探针用于免疫荧光标记技术中,对组织或细胞进行直接或间接标记,并已经取得了一定的进展。而且,通过构建不同的量子点荧光探针,可以对不同生物靶向分子进行多色标记,提高生物领域中多元(组分)检测的能力。目前,量子点免疫荧光标记已经成为分子生物学和细胞组织学等方面的很有前景的标记技术之一。
　　目的:
　　分析人胃粘膜组织中GCRG213的表达特征,探讨阳性表达细胞的分布规律。应用量子点免疫荧光标记技术检测胃粘膜组织中的GCRG213蛋白表达,并利用量子点进行免疫荧光双色标记,实现胃癌组织中GCRG213蛋白和Ki67蛋白表达的同时检测。
　　方法:
　　1. GCRG213蛋白在人胃粘膜组织中的表达特征利用本实验室制备的(鼠抗人)抗GCRG213蛋白单克隆抗体,应用免疫组织化学方法检测GCRG213蛋白在石蜡包埋的人正常胃粘膜组织中的表达;采用苏木素-伊红法对相应组织的连续切片染色。
　　2.量子点对胃癌相关蛋白的免疫荧光双色标记
　　(1)利用EDC(偶联剂)将QDs与Ki67抗体偶联;应用 QDs-anti-Ki67复合荧光探针检测胃癌组织Ki67表达。
　　(2)分别应用 QDs-链霉亲和素系统对胃粘膜组织中 GCRG213蛋白和 Ki67蛋白进行免疫荧光标记。
　　(3)利用量子点免疫荧光标记技术对胃癌组织中GCRG213蛋白和Ki67蛋白进行同时检测。
　　结果:
　　免疫组织化学研究显示,抗GCRG213单克隆抗体可以成功检测胃粘膜组织中的GCRG213蛋白的表达,在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,在正常胃粘膜的泌酸腺区中,部分固有腺体细胞有一定程度的表达。结合HE染色,GCRG213蛋白阳性表达的细胞为主细胞,而在正常胃粘膜的壁细胞、颈粘液细胞、表层上皮细胞及幽门腺等则为阴性表达。
　　QDs通过 EDC可与 Ki67抗体有效偶联,琼脂糖凝胶电泳检测证实了QDs-anti-Ki67复合探针的偶联,该复合物探针被成功地应用于检测Ki67蛋白的表达,检测的Ki67阳性信号为红色,位于细胞核。
　　成功利用QDs-链霉亲和素系统对胃粘膜组织中GCRG213蛋白和Ki67蛋白进行免疫荧光标记。组织切片中红色阳性信号与传统免疫组化中的棕色阳性信号位置对应。GCRG213阳性表达信号位于细胞浆,Ki67阳性表达信号位于细胞核。
　　利用量子点免疫荧光双色标记技术在同一张胃癌组织切片上同时检测GCRG213和 Ki67蛋白的表达,成功实现了量子点对胃癌组织中相关蛋白的免疫荧光双色标记。其中红色荧光标记的 GCRG213蛋白位于胞浆,绿色荧光标记的Ki67蛋白位于胞核。量子点荧光信号稳定,标记的标本可长时间保存备用。
　　结论:
　　本研究首次观察到 GCRG213在人正常胃粘膜泌酸腺区的固有腺体有特征性的表达,阳性细胞为主细胞。量子点通过 EDC可以与 Ki67抗体成功偶联,该抗体复合物可以对胃癌组织相关靶向蛋白进行有效的免疫荧光标记。采用量子点免疫荧光标记技术对胃癌组织中的GCRG213和Ki67蛋白成功地进行了双色标记,实现了两种蛋白的同时检测。本研究对促进纳米技术在临床医学的应用具有重要意义。

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前言

第一部分GCRG213蛋白在人胃粘膜组织中的表达特征

1 材料与对象

1.1仪器及设备

1.2 试剂

1.3主要试剂配制

1.4蜡块标本

2 实验方法

2.1传统免疫组织化学方法检测GCRG213蛋白在人胃粘膜组织中的表达

2.2苏木素-伊红染色（HE染色）

2.3图像采集与分析

3 实验结果

3.1 GCRG213蛋白在胃粘膜不典型增生和腺癌组织中表达情况

3.2 GCRG213蛋白在正常胃粘膜组织中表达情况

4 讨论

5 小结

第二部分量子点对胃癌相关蛋白的免疫荧光双色标记

1 材料与对象

1.1仪器及设备

1.2 试剂

1.3 主要试剂配制

1.4蜡块标本

2 实验方法

2.1 QDs偶联的Ki67抗体对胃癌组织中Ki67蛋白的免疫荧光标记

2.2 应用QDs-链霉亲和素系统对胃粘膜组织中表达的GCRG213蛋白免疫荧光标记

2.3 应用QDs-链霉亲和素系统对胃癌组织中表达的Ki67蛋白免疫荧光标记

2.4 利用量子点免疫荧光标记技术对胃癌组织中GCRG213蛋白和Ki67蛋白进行同时检测

2.4 图像采集与分析

3 实验结果

3.1 QDs偶联的Ki67抗体对胃癌组织中表达的Ki67蛋白免疫荧光标记

3.2 应用QDs-链霉亲和素系统对胃粘膜组织中表达的GCRG213蛋白免疫荧光标记

3.3 应用 QDs-链霉亲和素系统对胃粘膜组织中表达的 Ki67 蛋白免疫荧光标记

3.4利用量子点免疫荧光标记技术对胃癌组织中GCRG213蛋白和Ki67蛋白进行同时检测

4 讨论

5 小结

参考文献

综述

攻读学位期间发表文章情况

致谢