微纳形貌钽及钽/羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞生物学活性的影响

摘要

随着种植牙技术的发展和普及，越来越多的人将种植牙作为缺牙修复的首要选择。种植体与周围骨之间快速、稳定的骨结合是种植牙成功的关键，也是种植体表面改性的主要目标。
　　种植体的表面形貌和化学成分是影响骨整合能力的重要因素。涂层修饰能够有效地改善种植体表面理化性质，形成有利于骨整合的材料/细胞界面，从而提高种植体的骨整合性能。羟基磷灰石(HA)是常见的种植体表面涂层材料，然而良好的生物活性并不能弥补其脆性大及界面结合强度低等弱点。在羟基磷灰石中掺入添加剂制备复合涂层是提高其力学性能的重要发展方向。多孔钽凭借其优异的生物学性能，被视作新一代的金属植入材料，已在关节外科领域取得了显著的临床疗效。近年来，钽作为表面涂层材料，引起了人们的广泛兴趣。目前，通过对生物材料的微观结构和性能设计来调控干细胞的生物学行为是国内外研究的热点。从仿生学角度，微纳结构能更好地模拟细胞生存的微环境，有利于骨组织的修复再生。
　　本研究中我们采用大气等离子喷涂技术，在纯钛表面制备微纳形貌的钽以及钽/羟基磷灰石复合涂层并检测其表面理化特性。以大鼠骨髓间充质干细胞为模型，体外研究钽以及钽/羟基磷灰石复合涂层对骨髓间充质干细胞的粘附、增殖以及成骨分化等生物学行为的影响，为进一步动物体内研究涂层种植体骨结合性能奠定基础，为种植体表面改性的优化设计提供新思路以及新型种植体的探索提供理论依据。
　　第一部分微纳形貌钽涂层对骨髓间充质干细胞生物学活性的影响
　　目的:研究钛表面微纳形貌钽涂层的表面理化特性以及蛋白吸附性能，探讨微纳形貌钽涂层对骨髓间充质干细胞粘附、增殖和成骨分化等生物学行为的影响，以评价其细胞相容性，并为种植体表面改性的优化设计提供参考依据。
　　方法:
　　1、在本课题组前期的研究基础上，利用大气等离子喷涂技术在纯钛表面制备微纳形貌的钽涂层。经过参数优化，电弧功率设定为25KW，喷射距离为130mm。
　　2、利用扫描电子显微镜观察试样的表面形貌，衍射仪分析其物相组成，轮廓仪检测试样的粗糙度并测定表面接触角;采用垂直拉伸法测定涂层试件的结合强度;
　　3、采用MicroBCA法对试件表面吸附蛋白进行定量检测。
　　4、通过全骨髓贴壁培养法分离原代大鼠骨髓间充质干细胞、培养扩增并进行流式分子表型鉴定以及成脂、成骨分化鉴定。
　　5、将BMSCs与材料共培养，通过细胞核染色、计数材料表面粘附细胞，采用扫描显微镜、激光共聚焦显微镜观察细胞形态和细胞骨架，MTS法检测细胞增殖活力。
　　6、对材料表面BMSCs进行成骨诱导，通过碱性磷酸酶活、茜素红染色以及细胞分泌Ⅰ型胶原、骨钙素含量考察骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。
　　7、采用Rea-time PCR方法检测材料表面细胞成骨分化相关基因RuNX2、ALP、BMP-2和OPN的表达水平。
　　结果:
　　1、纯钛表面的钽涂层形成浅碟状微米坑和纳米孔隙的微纳多级复合结构。
　　2、对比纯钛和钛涂层，微纳结构钽涂层的粗糙度较高，而表面接触角较小，并与基体具有较高的界面结合强度。
　　3、微纳结构的钽涂层吸附蛋白能力优于纯钛和钛涂层。
　　4、骨髓间充干细胞在钽涂层表面粘附的数量明显较多，伸展良好，而且细胞骨架排列有序。培养4天后，微纳形貌涂层表面细胞的增殖活力开始高于纯钛。
　　5、相对于纯钛，微纳结构涂层显著促进了BMSCs的碱性磷酸酶的活性、Ⅰ型胶原和骨钙素的分泌和细胞外基质的矿化，并且上调了成骨分化相关基因的表达，钽涂层更为明显，差异有统计学意义。
　　结论:
　　1、采用等离子喷涂技术在纯钛表面形成的微纳形貌钽涂层致密均匀、结合力强且具有良好的亲水性和蛋白吸附能力。
　　2、微纳米形貌钽涂层具有较好的细胞相容性，能够促进BMSCs的粘附、增值和成骨分化能力。
　　第二部分微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层对骨髓间充质干细胞生物学活性的影响
　　目的:采用大气等离子喷涂技术，在纯钛表面制备微纳形貌的钽/羟基磷灰石复合涂层并研究其表面特性，考察微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响，以评价其生物相容性，为开发新型人工牙种植体提供依据，并筛选细胞相容性最佳的复合涂层。
　　方法:
　　1、采用大气等离子喷涂技术，优化参数，在纯钛表面制备微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层。
　　2、通过扫描电子显微镜、X射线衍射仪、接触角测试仪和粗糙度仪分别检测涂层试样的微观形貌、物相组成、湿润性和粗糙度，以表征其理化特性。
　　3、利用万能力学试验机测定涂层的结合强度，并用BCA法定量分析涂层试样吸附蛋白能力。
　　4、将骨髓间充质干细胞与不同质量比例的微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层共培养，采用扫描电镜和荧光显微镜观察材料表面的细胞形态并对细胞计数，MTS法检测细胞活性。
　　5、对材料表面的BMSCs进行成骨诱导，采用全自动生化仪定量检测细胞分泌钙、碱性磷酸酶和骨钙素的能力，采用茜素红染色法半定量细胞外基质矿化水平，通过实时定量PCR方法检测细胞成骨相关基因表达水平。
　　结果:
　　1、纯钛表面形成微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层，且均致密均匀，与基体结合良好。
　　2、随着钽质量比的增加，涂层的粗糙度呈增加趋势，亲水性逐渐降低，结合强度也逐渐增大，均介于钽涂层和羟基磷灰石涂层之间，且具有良好的亲水性和结合强度。
　　3、复合涂层蛋白吸附能力强于羟基磷灰石涂层和纯钛，不同质量比例的复合涂层组间并无统计学差异。
　　4、骨髓间充质干细胞在微纳形貌钽/羟基磷灰石复合涂层表面粘附的数量明显较多，且充分伸展良好。培养3天后，微纳形貌复合涂层表面细胞的增殖活力开始高于纯钛。
　　5、相对于纯钛，微纳形貌涂层显著促进了BMSCs的碱性磷酸酶活性、Ca和骨钙素分泌以及细胞外基质矿化，并且上调了成骨分化相关基因的表达水平，其中HA1Ta9和HA2Ta8涂层与羟基磷灰石涂层也具有统计学差异。
　　6、钽/羟基磷灰石复合涂层促进BMSCs的成骨分化能力呈现一定的规律性，即HA1Ta9＞HA2Ta8＞HA3 Ta7＞ HA4Ta6。
　　结论:
　　1、微纳形貌钽HA复合涂层的亲水性和蛋白吸附能力优于钽涂层，而涂层结合力强度大于HA涂层，具有良好的生物相容性和力学性能。
　　2、相对于喷砂钛和单一涂层，微纳形貌钽/HA复合涂层具有更好的细胞相容性，能够显著促进细胞的粘附、增值和成骨分化能力，
　　3、钽/羟基磷灰石复合涂层促进BMSCs成骨分化能力依次为HA1Ta9＞HA2Ta8＞HA3Ta7＞ HA4Ta6。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

实验一 纯钛表面微纳形貌钽涂层的制备及其表面特性研究

引言

材料与方法

结果

讨论

实验二 微纳形貌钽涂层对骨髓间充质干细胞生物学活性的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

实验三 纯钛表面微纳形貌钽／羟基磷灰石复合涂层的制备及其表面特性研究

引言

材料与方法

讨论

结论

实验四 微纳形貌钽／羟基磷灰石复合涂层对骨髓间充质干细胞生物学活性的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述 多孔钽作为骨植入材料的研究进展

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