靶向表皮生长因子受体的新型前抗体制备及抗肿瘤功能研究

摘要

目的:帕妥木单抗(Panitumumab)是一种已上市的特异性靶向表皮生长因子受体(EGFR)的抗体。然而由于其是一种IgG2亚类抗体，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)较弱。因此我们将帕妥木单抗的可变区移植到IgG1亚类的骨架区后得到新型抗体Pan，以提高其ADCC活性。接下来，利用ProbodyTM技术对Pan进行改造，构建了可被尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)激活的新型前抗体Pan-P，以期能减轻抗EGFR抗体引起的毒副反应。综上所述，本课题旨在构建具有强抑瘤效能且可被选择性激活的前抗体，以达到在增强疗效的同时降低其皮肤毒性的目的。
　　方法:首先，利用基因工程技术将帕妥木单抗的可变区基因连接到IgG1亚类抗体Fc段，转入CHO细胞中表达、纯化得到新型抗体Pan。利用以下手段对其进行表征分析:SDS-PAGE等分析其分子量和纯度;Biacore和ELISA测定抗体的亲和力和抗原结合力;CCK-8试验测定抗体对A431细胞的生长抑制效应;LC-MS测定Pan的糖型比例;ADCC报告基因试验评估其体外ADCC活性。最后，在荷瘤小鼠体内评估其抑瘤活性。
　　其次，利用ProbodyTM技术对Pan抗体进行改造。改造方法为在其轻链N端添加了封闭肽、连接肽及酶切底物肽等序列而得到了前抗体Pan-P。利用以下方法对其进行表征分析:SDS-PAGE、LC-MS分析其可被uPA特异性酶切的特性;Biacore、ELISA及FACS表征其可被uPA酶切且激活的特性;CCK-8试验测定其激活后对A431及DiFi细胞生长抑制的活性;冰冻组织原位染色技术评估Pan-P在结直肠癌患者肿瘤组织的酶切激活特性;同时在荷瘤小鼠体内评估Pan-P的酶切激活后靶向性。最后，在荷瘤小鼠体内评估其抑瘤活性。
　　结果:我们获得了Pan抗体，经分析其纯度大于99％。经测定，Pan的亲和力约为7.4×10-10M，与帕妥木单抗相似。同时，CCK-8试验也证实其保持了帕妥木单抗对A431细胞的生长抑制效能。更重要的是，我们发现在Pan的糖型比例中，非岩藻糖修饰的糖型比率为33％左右，这可能有助于增强其ADCC活性。在ADCC报告基因试验中，Pan介导ADCC效应的效能显著高于帕妥木单抗。尤其值得注意的是，Pan显示的体内抑瘤效能较之帕妥木单抗更强。在此基础上改造得到的前抗体Pan-P可被酶切激活而恢复完全功能活性。具体结果如下:SDS-PAGE、LC-MS等试验证实uPA可对Pan-P进行特异性酶切。Biacore、ELISA及CCK-8等试验证实Pan-P可被酶切激活而恢复与Pan相似的功能活性。更重要的是，Pan-P在结直肠癌患者肿瘤组织中亦可被酶切激活。最后，在荷瘤小鼠体内证实了Pan-P的靶向性及抑瘤活性。
　　结论:综上所述，我们最终得到了具有酶激活特性及增强的抗肿瘤效能的前抗体Pan-P。未来用于结直肠癌等的治疗时，将有望增强治疗效果并缓解抗EGFR拮抗剂对正常组织的毒性，提升治疗指数。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 抗体Pan的构建、表达与鉴定

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分 抗体Pan的体外及体内功能活性分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三部分 前抗体Pan-P的构建、表达及鉴定

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第四部分 前抗体Pan-P的体外及体内功能活性分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

总结

参考文献

综述 靶向人表皮生长因子受体的抗体药物研究进展

英文缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

致谢