嵌合抗原受体修饰的NK细胞在多发性骨髓瘤中的应用研究

摘要

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种浆细胞系统恶性克隆性疾病，主要特征为浆细胞克隆性增值并导致血和尿中出现大量免疫球蛋白M蛋白。目前治疗主要根据患者的危险度分层进行个体化治疗，虽然新药如免疫调节剂及蛋白酶体抑制剂的使用延长了患者的生存期，但大部分患者最终疾病会复发，因而就需要更新的治疗药物及方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CARs)修饰的淋巴细胞治疗恶性肿瘤是一种新的免疫治疗方法。前期研究发现嵌合抗原受体修饰的NK细胞具有抗骨髓瘤效应，为临床使用该项技术提供了理论依据。 目的:该研究主要探讨嵌合抗原受体设计的NK细胞的抗骨髓瘤效应
　　方法:
　　本研究首先提取Jurkat细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR的方法合成CD28片段和CD3ζ片段，紫外光下切胶回收片段，通过双酶切连接的方法使每个片段连接到pcDNA3.1质粒，抗CD138scFv片段由我院生物治疗科提供片段由基因公司合成并连接到pcDNA3.1质粒，DNA测序正确后继续双酶切连接的方法使三个片段首尾彼此相连成融合片段，测序正确后，双酶切片段回收连接到pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro质粒，通过三质粒慢病毒包装系统(pSPAX2，pMD2G，pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro)转染293T细胞，收集病毒并测定病毒滴度，接着使用病毒感染NK92MI细胞系，并通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，建立稳定转染细胞株后，通过PCR及Western Blot验证CAR(抗CD138-CD28-CD3ζ)在NK92MI细胞系的表达，验证正确后进行细胞试验。在细胞试验中，通过流式细胞仪检测NK92MI细胞分泌细胞因子cd107a的能力，并进行统计学分析。从而在细胞水平验证CAR-NK细胞的抗骨髓瘤作用。
　　结果:
　　①通过基因工程技术，体外构建CAR基因片段，通过基因测序验证基因序列正确。
　　②经过病毒包装技术，获得表达该片段的病毒株。
　　③经过病毒转染实验，获得表达CAR融合蛋白的稳转NK细胞株。
　　④经PCR及Western Blot证实CAR融合蛋白在NK细胞表达。
　　⑤细胞杀伤实验证实CARNK细胞具有明显的杀伤多发性骨髓瘤的效应，CARNK细胞分泌细胞因子cd107a的能力明显优于对照组。
　　结论:
　　①CAR(抗CD138-CD28-CD3ζ)能在体外构建并在NK92细胞表面表达
　　②CAR NK细胞能杀伤表达cd138抗原的多发性骨髓瘤细胞株，从而发挥抗骨髓瘤效应。

目录

声明

摘要

引言

第一节 多发性骨髓瘤的免疫治疗研究背景

第二节 嵌合抗原受体的研究背景

第三节 嵌合抗原受体细胞应用于多发性骨髓瘤

第一部分 CAR的体外构建和建立稳转细胞

1．材料

2 方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第二部分 CAR NK的鉴定和功能研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．小结

全文结论

参考文献

综述 嵌合抗原受体修饰淋巴细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

缩略词表

攻读学位期间发表文章

致谢