人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力差异以及调控机制的初步研究

摘要

目的：
　　体外分离、培养人脱落乳牙牙髓干细胞和恒牙牙髓干细胞，对比二者一般生物学特性及成骨诱导和破骨分化能力。筛选并分析SHED参与乳牙牙根生理性吸收过程的关键因子，初步探讨SHED可能参与骨改建的调控机制，为干细胞应用于正畸临床骨改建、加速牙齿移动提供一定实验依据。
　　方法：利用酶消化法、有限稀释法分离纯化获得SHED及DPSCs。观察细胞生长及形态，细胞克隆形成率，MTT法测生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期。利用矿化诱导液对SHED和DPSCs向成骨细胞诱导，分别在诱导14天、21天行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，并对矿化结节进行计数。采用实时荧光定量PCR检测成骨诱导7d后SHED和DPSCs成破骨相关基因RUNX2、OCN、COL-1、ALP、RANKL和OPG的表达情况，初步探讨对比SHED和DPSCs的成骨分化及破骨能力差异。RT-PCR检测SHED和DPSCs的TNF-α、IL-6、NF-κB、OPG、RANKL表达情况，Western Bolot检测SHED和DPSCs全细胞蛋白中TNF-α、NF-κB的表达水平，并进行相关蛋白表达灰度分析。
　　结果：(1)通过酶消化法、有限稀释纯化法获得了SHED和DPSCs，两种干细胞的形态均为成纤维细胞样，而SHED呈现多形性，有短梭形、扁平形、多角形和椭圆形等形状，DPSCs可见单个细胞呈梭形、星形，胞浆均匀、核圆、核仁清晰。SHED克隆形成率高于DPSCs，且两种干细胞之间存在显著性差异(p＜0.05)。SHED和DPSCs的生长曲线趋势均呈“S”型，SHED从第3d开始进入对数生长期，而DPSCs从第4d进入对数生长期，且SHED达到峰值显著高于DPSCs,说明SHED增殖能力强于DPSCs。细胞周期分析结果，G2/M+S期:SHED为35.54％，DPSCs为24.14％，且差异具有统计学差异(p＜0.05)，提示SHED具有更强的细胞自我复制及增殖能力。SHED和DPSCs在成骨向诱导14d后，ALP染色均呈阳性表达，且多数细胞质有蓝紫色颗粒沉淀，SHED比DPSCsALP阳性表达率更高;成骨向诱导21d后，茜素红染色均为阳性，两种细胞均可见有矿化结节形成，SHED的数量显著多于DPSCs，且SHED形成结节面积较大、稠密，而DPSCs形成分散、面积较小的矿化结节。以上结果可提示SHED较DPSCs有更强成骨分化能力。(2) RT-PCR检测结果显示，成骨诱导后，成骨相关基因Runx2、OCN、ALP和OPG在SHED和DPSCs中均有表达，SHED的Runx2、OCN、ALP和OPG表达量增加高于DPSCs，该结果再次证明SHED较DPSCs具有较强成骨分化能力。且两种细胞均表达OPG和RANKL,在破骨相关基因RANKL的表达上，与DPSCs相比，SHED呈明显上调趋势，在反应细胞破骨与成骨能力的RANKL/OPG比值上，SHED显著高于DPSCs，结果表明，与DPSCs相比，SHED还兼具较强的破骨能力。(3) SHED和DPSCs均表达TNF-α、IL-6、NF-κB等炎性相关因子，SHED在TNF-旺、IL-6、NF-κB表达水平明显高于对照组DPSCs，差异具有统计学意义(P＜0.05);在TNF-α表达上，SHED表达量约为DPSCs3倍;在IL-6表达上，SHED表达量约为DPSCs3倍;在NF-κB表达上，SHED表达量约为DPSCs7倍;在RANKL/OPG比值上,SHED约为DPSCs的2.5倍，以上差异具有统计学意义(p＜0.05)。WesternBolot检测结果显示SHED中TNF-α和NF-κB蛋白表达水平显著高于DPSCs。相关蛋白表达灰度分析结果显示，在TNF-α表达上，SHED是DPSCs的大约2.5倍;在NF-κB表达上，SHED是DPSCs的大约1.9倍，以上差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　结论：本研究成功从人脱落乳牙牙髓和恒牙牙髓中分离出SHED和DPSCs，与DPSCs相比，SHED增殖能力强，倍增时间短，且具有较高克隆形成能力。经成骨诱导后，SHED较DPSCs具有更强的成骨分化能力。此外，SHED还兼有较强的破骨能力。在乳牙生理性根吸收、牙根周围骨改建的过程中，SHED可能通过分泌TNF-α等炎症因子诱导活化NF-κB信号通路，NF-κB信号通路的激活作用于RANK/RANKL/OPG系统的调节，使RANKL/OPG比值明显变大，促进破骨细胞分化成熟以及牙根周围骨改建，从而提示SHED可能参与生理性牙根吸收骨改建，为干细胞应用于正畸临床骨改建、加速牙齿移动提供一定实验及理论依据。

目录

声明

中英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 人脱落乳牙牙髓干细胞和恒牙牙髓干细胞分离、培养及生物学特性研究

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

第二部分 人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力差异的实验研究

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

第三部分 人脱落乳牙牙髓干细胞参与生理性根吸收骨改建的调控机制研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

全文总结

综述

攻读学位期间发表文章情况

致谢