微小RNA在HMGB1介导小鼠脾脏树突状细胞免疫功能中的调控作用及其调节机制

摘要

目的:脓毒症时高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为晚期炎症介质和损伤相关分子模式(DAMPs)的重要成员能诱导树突状细胞(DCs)免疫功能紊乱，但其分子调控机制仍不清楚。微小RNA(miRNAs，miR)对mRNA发挥着转录后精细调控作用。本研究拟从miRNAs的角度探讨HMGB1诱导DCs成熟活化的分子调控机制，旨在为进一步探索严重烧（创）伤后脓毒症的免疫调控途径提供新线索。
　　方法:第一部分，外源性HMGB1对小鼠脾脏DCs细胞免疫功能的影响。参考本实验室前期对大鼠脾脏DCs研究的基础，用0、100、1000ng/ml三个浓度的重组HMGB1刺激正常小鼠脾脏DCs，48h后分别应用流式细胞术检测DCs表面标志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHCⅡ)的表达情况;应用ELISA技术检测DCs分泌细胞因子IL-12、TNF-α的水平;将HMGB1刺激48h后的DCs与脾脏T淋巴细胞按1∶100的比例共培养，于3天(d)后采用CCK-8试剂盒观察T淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应，用ELISA技术检测培养液中干扰素(IFN-γ)（判断Th1/Th2功能分化）和IL-2（反映T细胞的分泌功能）的表达水平，最终确定HMGB1诱导DCs成熟活化的适合剂量。第二部分，HMGB1诱导小鼠脾脏DCs成熟活化后miRNA表达谱的研究。采用miRNAs芯片检测经HMGB1刺激活化后DCs中miRNAs表达谱的变化。结合芯片结果和文献报道，锁定可能发挥作用的差异表达miR:miR-181a-5p，通过RT-PCR方法验证该miR的表达量变化情况。第三部分，miR-181a-5p靶基因预测以及体外功能验证实验。运用计算机预测miR-181a-5p的靶mRNA，采用双荧光素酶报告系统证实这一假设，转染miR-181a-5p的mimics或inhibitor上调或下调细胞内该miR表达量，用RT-PCR方法检测其靶mRNA的表达量，从功能上验证miR-181a-5p对靶mRNA的调控作用。
　　结果:第一部分，与正常对照组(HMGB1浓度0ng/ml组)相比，HMGB1(100ng/ml和1000ng/ml)作用48h后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达以及DCs分泌IL-12、TNF-α的水平均呈现双向调控现象，即在HMGB1浓度为100ng/ml时上调显著(P＜0.05或P＜0.001)，而HMGB1浓度为1000ng/ml时各指标反而有所下降，尤其是IL-12，分泌水平反而低于HMGB1(0ng/ml)组(P＜0.01);DCs与脾脏T淋巴细胞共培养后，经HMGB1刺激的DCs能显著增强T淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应(P＜0.01)，促进T细胞向Th1细胞极化[IFN-γ表达水平显著增加(P＜0.01)]以及T细胞分泌功能增加[IL-2表达水平显著升高(P＜0.01)]，且符合上述双向调控现象，各指标在HMGB1（100ng/ml）组表达水平最高。通过本部分实验我们确定了100ng/ml为诱导DCs成熟活化的适合剂量。第二部分，100ng/mlHMGB1刺激DCs后用miRNAs芯片筛选出14个差异表达miRNAs，结合文献推测上调的miR-181a-5p(P＜0.05)可能与HMGB1诱导的DCs免疫功能紊乱密切相关。运用RT-PCR技术验证了其上调趋势(P＜0.01)和芯片结果一致，且也存在HMGB1的双向调控现象。第三部分，通过计算机预测TNF-α3'untranslated region(UTR)可能存在miR-181a-5p的靶基因位点，于是构建包含预测靶位点的TNF-α野生型(WT)和TNF-α突变型(MUT)载体进行荧光素酶实验，结果显示:与对照组相比较，miR-181a-5p能使WT组载体的荧光强度显著下降(P＜0.001)。此外，我们对DCs转染miR-181a-5p mimics后，发现DCs内TNF-αmRNA的表达量下调显著(P＜0.01)，而转染miR-181a-5p inhibitors后则显著增强其TNF-αmRNA的表达(P＜0.001)。
　　结论:通过本项研究，我们证实了外源性HMGB1对小鼠脾脏DCs免疫功能及细胞内的miR-181a-5p均具有双向调控作用。合适剂量的HMGB1刺激小鼠脾脏DCs后，能诱导DCs成熟活化，并通过上调miR-181a-5p对细胞内的TNF-αmRNA发挥负性调控作用。这一调控机制可能和脓毒症时机体从最初的高炎症反应状态转变为晚期的免疫抑制状态密切相关。

目录

声明

摘要

英文缩略表

前言

第一部分 外源性HMGB1对小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响

一、材料与方法

1 仪器及试剂

2 实验动物

3 实验方法与观察指标

4 统计学处理

二、结果

2 外源性HMGB1刺激后DCs表面共刺激分子表达的变化

3 外源性HMGB1刺激后DCs分泌细胞因子的变化

4 外源性HMGB1刺激后DCs诱导T淋巴细胞增殖及活化的变化

三、讨论

四、结论

第二部分 HMGB1诱导小鼠脾脏树突状细胞成熟活化后miRNA表达谱的研究

一、材料与方法

1 仪器及试剂

2 实验动物

3 实验方法与观察指标

4 统计学处理

二、结果

1 HMGB1刺激DCs成熟后miRNAs表达谱芯片检测及数据分析

2 筛选可能与DCs免疫功能密切相关的miRNA并验证其表达量

三、讨论

四、结论

第三部分 miR-181a-5p靶基因预测以及体外功能验证实验

1 仪器及试剂

2 实验动物

3 实验方法与观察指标

4 统计学处理

二、结果

1 预测miR-181a-5p的靶基因位点

2 构建野生型、突变型重组质粒

3 双荧光素酶实验

4 miR-181a-5p对DCs中TNF-α mRNA表达的负向调控作用

三、讨论

四、结论

全文总结

参考文献

文献综述(一)微小RNA在脓毒症早期诊断和预后评估中的价值

文献综述(二)微小RNA调节树突状细胞成熟及免疫功能的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢