氩氦冷冻消融联合GM-CSF治疗胶质瘤小鼠的疗效及其对小鼠脾脏树突状细胞免疫功能影响

摘要

本文分以下两章进行探讨：
　　第一章 C57BL/6小鼠GL261小鼠脑胶质瘤模型建立及氩氦冷冻联合GM-CSF治疗的生存期观察
　　目的：
　　观察氩氦冷冻联合GM-CSF治疗荷胶质瘤小鼠的疗效。
　　内容：
　　(1)荷胶质瘤小鼠模型的建立;
　　(2)观察不同治疗方案对胶质瘤小鼠的治疗效果，包括一般情况及肿瘤大小等;
　　(3)荷胶质瘤小鼠生存期。
　　方法:
　　1、荷胶质瘤小鼠模型建立及分组:GL261胶质瘤细胞株复苏、传代后，制备单细胞悬液，种植于C57BL/6小鼠背部靠近臀部处皮下，建立小鼠胶质瘤模型;肿瘤组织行HE染色进行肿瘤组织的形态学观察，确定荷胶质瘤小鼠模型的成功建立;造模成功的小鼠随机分为模型对照组、单纯GM-CSF注射组、单纯氩氦冷冻组和氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组。
　　2、观察各组小鼠肿瘤大小及荷瘤小鼠的生存期:接种后每天密切观察小鼠活动情况:小鼠迸食是否正常，毛色是否光滑整齐，背部接种部位是否膨隆;接种后每3天测量一次小鼠的体重，隔日观察小鼠皮下胶质瘤的成瘤及生长情况，根据测量的肿瘤最大长径A和最小宽径B，计算肿瘤的体积(其体积为A×B2/2);记录小鼠生存时间，以70天为观察终点，绘制生长曲线图。
　　3、统计学分析:所有实验数据均采用21.0统计软件进行处理，计量资料数据以(x)±s表示。各个治疗组小鼠的生存时间记录为:平均生存时间（天）±标准差，采用Kaplan-Meier生存分析法描绘各个治疗组小鼠生存分析曲线，组间比较采用log-rank检验，多重比较采用Bonferroni校正，都与Cryo+GM-CSF组比较，共三次，校正后检验水准为0.05/3=0.0167;各治疗组小鼠肿瘤体积的变化采用重复测量的方差分析，各时间点之间的多重比较采用LSD方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、GL261细胞呈贴壁生长，状态良好;小鼠接种胶质瘤细胞后，进食未见明显异常，活动稍受限，毛发光泽度较前稍差，接种部位随时间延长逐渐膨隆，表面无破溃、出血;种植肿瘤细胞后第14-16天，肉眼可见小鼠背部接种部位明显膨隆，肿块大小约为2.5-3.0cm3，表面无破溃;肿瘤组织光学显微镜下观察，肿瘤细胞呈圆形、梭形或多角形，排列紊乱，细胞核呈圆形或不规则形，染色质深染，病理性核分裂象活跃，局部可见坏死区域;
　　2、动态观察不同治疗组荷瘤小鼠肿瘤大小的变化:
　　单纯GM-CSF注射治疗可以延缓小鼠胶质瘤生长，但不能杀灭肿瘤，抑制肿瘤生长;单纯氩氦冷冻治疗可以在一定程度上减小了肿瘤的体积;而二者联合治疗后可以呈现协同效应，明显抑制了肿瘤的生长
　　3、各种不同治疗方案对荷瘤小鼠生存时间的影响:各组小鼠平均生存时间（天）分别为:模型对照组38.10±1.77，单纯GM-CSF注射组43.40±2.14，单纯氩氦冷冻组63.80±2.77，氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组69.80±0.19，氩氦冷冻联合GM-CSF组小鼠平均生存时间最长，其次是单纯氩氦冷冻组，单纯GM-CSF注射组和模型对照组小鼠均未存活至观察终点，各组生存时间相比，差异有统计学意义（x2=47.300，P＜0.001）。
　　结论:
　　1、荷胶质瘤小鼠模型成功建立:该方法可以成功建立C57BL/6小鼠GL261胶质瘤模型，形成的肿瘤组织光镜下观察符合恶性胶质瘤的生物学行为。建立的胶质瘤模型生长期符合预期，种植肿瘤细胞后第14-16天，肉眼可见小鼠背部接种部位明显膨隆，肿块大小约为2.5-3.0cm3，表面无破溃。适合行各种治疗干预。
　　2、不同治疗方案对胶质瘤小鼠的治疗效果:单纯GM-CSF注射治疗可以延缓小鼠胶质瘤生长，但不能杀灭肿瘤，抑制肿瘤生长;单纯氩氦冷冻治疗可以在一定程度上减小了肿瘤的体积;而二者联合治疗后可以呈现协同效应，明显抑制了肿瘤的生长。
　　3、氩氦冷冻联合GM-CSF治疗可以延长荷胶质瘤小鼠的生存期。
　　第二章 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗对荷脑胶质瘤小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响
　　目的：
　　探讨氩氦冷冻联合GM-CSF治疗荷胶质瘤小鼠是否可通过引起脾脏DCs活化来引起特异性抗肿瘤免疫，为进一步探索胶质瘤免疫治疗提供一个理论依据。
　　内容：
　　(1)荷胶质瘤小鼠模型的建立;
　　(2)动态观察不同治疗方案治疗前后小鼠脾脏DCs数量变化及活化情况，明确氩氦冷冻联合GM-CSF是否可以有效活化DCs从而将肿瘤特异性抗原呈递给T细胞，激活机体抗肿瘤免疫以杀死胶质瘤细胞。
　　方法：
　　1、荷胶质瘤小鼠模型建立及分组:将成功种植GL261细胞并成瘤的荷瘤小鼠随机分为模型对照组、单纯GM-CSF注射组、单纯氩氦冷冻组和氩氦冷冻联合GM-CSF治疗组，每组20只。各组动物分干预治疗前、治疗后7、14、21d共4个时间点，每个时间点在各组内随机抽取5只小鼠进行相关指标检测。
　　2、免疫组织化学法检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点DCs表面标记CD11c在脾脏的表达情况。
　　3、流式细胞术检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点的脾脏DCs的活化情况。
　　4、酶联免疫吸附法(ELISA)检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞IFN-γ的分泌水平。
　　5、LDH实验检测治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)的杀伤活性。
　　6、统计学分析:所有实验数据均采用21.0统计软件进行处理，数据以(x)±s表示。不同组间不同时间点采用2×2析因实验设计的方差分析，多重比较采用LSD。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、光镜下观察:CD11c主要表达于细胞膜表面，CD11c+细胞(DCs)主要分布于脾脏边缘区、脾索和淋巴滤泡处，体积较大，细胞核不规则。
　　2、免疫组化法检测脾脏中CD11c+细胞数在各个治疗组和不同时间点的动态变化情况:
　　单纯GM-CSF注射治疗和单纯氩氦冷冻治疗均可增加脾脏组织内DCs数量，但氩氦冷冻联合GM-CSF治疗对脾脏DCs数量的增加更明显，从时间变化趋势上看，联合治疗组DCs数量增加更明显，持续时间更长。
　　3、流式细胞术检测小鼠脾脏单位体积内DCs活化(CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD86+)在各治疗组和不同时间点的动态变化情况:
　　单纯GM-CSF注射治疗并不能增加脾脏组织活化DCs数量，单纯氩氦冷冻组脾脏DC细胞活化数量虽有所增加，但随时间延长迅速下降，而氩氦冷冻联合GM-CSF治疗能显著增加脾脏组织内活化DCs数量，且持续时间长。说明GM-CSF的免疫增强作用在有氩氦冷冻释放的抗原基础上起协同作用，大大提高了DCs的活化效率。
　　4、酶联免疫吸附法(ELISA)检测各治疗组在治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞IFN-γ的分泌水平:
　　单纯GM-CSF治疗并不能增加脾脏组织IFN-γ分泌量，单纯氩氦冷冻虽能一定程度上增加脾脏IFN-γ分泌量，但升高效果并不十分显著，而二者联合治疗能显著增加脾脏IFN-γ分泌量，且能在较长时间内维持高分泌量。
　　5、LDH实验检测治疗前和治疗后7天、14天、21天不同时间点脾脏细胞CTLs杀伤活性:
　　单纯GM-CSF注射治疗并不能增加脾脏组织CD8+CTLs的杀伤活性，单纯氩氦冷冻治疗能一定程度上增强脾脏CD8+CTLs的杀伤活性，而氩氦冷冻联合GM-CSF治疗后脾脏CD8+CTLs的杀伤活性明显增加，且持续时间较长。
　　结论：
　　采用免疫组化技术、流式细胞检测、ELISA实验和LDH实验等多种方法检测小鼠脾脏DCs的免疫功能变化，结果表明氩氦冷冻联合GM-CSF注射治疗能够增加DCs数量，增强脾脏DCs的活化，在体内促进DCs免疫功能活化，进而递呈胶质瘤抗原至T淋巴细胞，从而激活初始型T细胞，诱导出Th1型免疫应答，以及产生抗肿瘤细胞特异性CTL杀伤作用，其中GM-CSF对氩氦冷冻起到了协同和促进作用。本研究利用氩氦冷冻释放的肿瘤抗原，联合免疫增强剂GM-CSF注射，诱导出机体抗胶质瘤特异性的免疫反应，将胶质瘤的局部冷冻治疗与全身的抗肿瘤免疫反应结合了起来，为氩氦冷冻治疗的临床应用提供了一个理论基础。

目录

摘要

前言

第一章 C57BL／6小鼠GL261脑胶质瘤模型建立及氩氦冷冻联合GM-CSF治疗的生存期观察

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 研究目的

1．1．3 研究内容

1．2 材料与方法

1．2．1 实验材料

1．2．2 实验方法

1．2．3 统计学分析

1．3 结果

1．3．1 GL261细胞培养

1．3．2 造模后小鼠一般情况的观察

1．3．3 荷胶质瘤小鼠模型成功建立

1．3．4 动态观察不同治疗组荷瘤小鼠肿瘤大小的变化

1．3．5 不同治疗方案对荷瘤小鼠生存时间的影响

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗对荷脑胶质瘤小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响

2．1 引言

2．1．1 研究背景

2．1．2 研究目的

2．1．3 研究内容

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗明显提高脾脏DCs数量

2．3．2 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗能明显提高脾脏DCs活化数量

2．3．3 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗可以提高脾脏组织IFN-γ的分泌水平

2．3．4 氩氦冷冻联合GM-CSF治疗可以提高脾脏组织CD8+T淋巴细胞的杀伤活性

2．4 讨论

2．5 小结

全文结论

参考文献

综述 氩氦冷冻消融治疗脑胶质瘤的研究进展

中英文缩略词表

攻读学位期间获得成果

致谢

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