利拉鲁肽减轻心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制研究

摘要

目的:微血管是心脏终末循环的末梢，决定了组织灌注水平和氧供平衡。心梗缺血后的再灌注时期产生的大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是诱导冠脉末梢的CMEC(Cardiac Microvascular Endothelial Cells，CMEC)凋亡的主要因素之一。前期研究证实，黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)是CMEC在氧化应激条件下产生ROS的主要来源之一。如何减少CMEC的氧化应激损伤是防治急性心肌梗死再灌注损伤的重点。胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)近期被发现在心脏组织中具有抗氧化应激的作用。故本研究旨在探究GLP-1类似物利拉鲁肽(GLP-1 Analogue，Liraglutide)对CMEC生物学特性的影响，以及缺氧复氧模型(Hypoxia/Reoxygenation Model，H/R)条件下，Liraglutide保护CMEC免受氧化应激损伤的具体机制，以及提高CMEC的存活能力的分子信号通路的研究。
　　方法:双酶消化法体外分离培养SD大鼠CMEC，差速贴壁法进行纯化，CD31和Ⅷ因子抗体进行免疫细胞化学染色鉴定CMEC纯度，CD31和GLP-1R抗体进行免疫细胞化学共染细胞。采用不同浓度Liraglutide(0～100 nM)预干预后MTT绘制细胞生长曲线，BrdU荧光标记法和划痕实验观察药物作用下细胞增殖和迁移能力。建立H/R诱导的细胞氧化应激凋亡模型，流式细胞学检测细胞凋亡率，DCFHDA荧光探针检测胞内ROS的变化，Fura-3 AM荧光探针检测细胞内钙离子变化，免疫荧光染色和Western Blot检测XO、caspase3等蛋白分子的表达情况，利用通路阻断剂和干扰RNA技术，阐明Liraglutide通过激活PI3K/Akt-Survivin分子信号在抗细胞氧化应激过程中的保护作用机制。
　　结果:
　　1.体外分离SD乳鼠原代CMEC，72h后细胞呈典型“铺路石样”生长，CD31及Ⅷ因子免疫荧光染色提示双阳性率大于95％，说明CMEC纯度较高。
　　2.CD31和GLP-1R抗体免疫荧光共定位染色提示CMEC表达GLP-1受体，MTT示Liraglutide以浓度依赖方式促进CMEC的体外增殖，100 nM为其最适生长浓度。
　　3.予以Liraglutide预处理细胞24 h，BrdU和划痕实验均说明Liraglutide能以浓度依赖性促进CMEC的增殖和迁移能力。
　　4.通过缺氧4h复氧4h成功建立H/R模型，在该模型条件下可以显著提高胞浆ROS含量、诱导细胞凋亡;而Liraglutide预处理细胞12h可以通过降低ROS、进而减少凋亡细胞数量。
　　5.H/R模型诱导黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)表达增加，生成过量ROS及增加凋亡蛋白的表达。利用siRNA敲低XO或予以Liraglutide预处理可显著降低胞浆ROS水平，同时降低凋亡蛋白的表达。
　　6.H/R模型条件导致细胞胞浆钙超载，诱导XO表达增加，生成过量ROS及凋亡蛋白的表达。使用BAPTA中和钙离子或Liraglutide预处理12 h可明显减少XO表达，降低胞浆ROS水平，同时降低凋亡蛋白的表达。
　　7.H/R模型诱导过量胞浆XO-ROS生成，最终导致了线粒体膜电位降低、细胞色素c向胞浆渗漏，线粒体凋亡通路的激活。Liraglutide预处理12h或敲低XO可以在一定程度上逆转线粒体膜电位的丢失和细胞色素c向胞浆的渗漏，从而促进细胞存活。
　　8.H/R模型通过下调SERCA2a、促进IP3R转录，导致内质网钙通道失衡、诱导胞浆钙超载，从而升高XO的表达以及胞浆ROS的含量。阻断IP3R、鳌合胞浆钙、使用siRNA敲低XO，可以有效降低胞浆ROS水平，同时降低caspase3的表达;Liraglutide预处理12 h恢复SERCA2a的转录水平并下调IP3R的转录，抑制了H/R诱导的钙失衡、XO的激活，最终降低胞浆过量ROS并提高细胞存活。
　　9.Liraglutide预处理12 h，CMEC中p-Akt及survivin表达量升高，给与PI3K/Akt阻断剂LY294002后，survivin的表达下降。
　　10.H/R模型中分别阻断PI3K/Akt、敲低survivin或阻断GLP-1R，均可以降低Liraglutide对SERCA2a和IP3R转录的调节作用，诱发了下游钙离子失衡、过量ROS生成，及凋亡蛋白表达增加。
　　11.Liraglutide通过提高SOD、GSH和GPx的含量，维持胞内正常ROS水平。
　　结论:
　　1.Liraglutide是以浓度依赖方式通过激活胞内PI3K/Akt和MAPK/ERK通路促进原代大鼠CMEC的增殖和迁移。
　　2.H/R模型通过激活内质网钙超载诱导的细胞氧化应激损伤，导致损伤轴SR-Ca2+-XO-ROS激活，生成过量胞浆ROS，最终介导了CMEC的线粒体凋亡通路激活，而予以Liraglutide预处理可以逆转上述过程。
　　3.Liraglutide既能够通过提高SOD、GSH和GPx维持正常的胞内ROS水平，又可以通过激活GLP-1R/PI3K/Akt/survivin通路进而促进SERCA2a的表达和活性，最终降低钙超载引起的细胞氧化应激损伤，促进细胞存活。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 Liraglutide对CMEC生物学特性的影响

1 实验相关材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

4 结论

第二部分 Liraglutide减轻CMEC氧化应激所致细胞凋亡的机制

1 实验相关材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

文献综述 GLP-1对心血管保护的研究进展

硕士期间发表文章

致谢