脊髓背根神经节前体细胞在促进脊髓损伤功能恢复中作用的基础研究

摘要

随着现代工业生产和交通运输业的飞速发展，创伤性脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的发病率逐年上升，急性SCI后神经功能的预后十分不理想，常常导致运动、感觉完全或部分丧失以及自主神经功能障碍，整个社会家庭和个人带来了沉重的经济和心理负担。临床中对于脊髓损伤的治疗主要有手术治疗、药物治疗，包括类固醇激素、神经营养药物、脱水药，以及其他物理治疗等，但上述治疗手段未达到满意的治疗效果。因此，对脊髓损伤后如何促进神经修复和再生的研究成为广泛关注的热点问题。
　　细胞治疗是脊髓损伤神经修复提供一种具有广阔前景治疗手段。然而，寻找合适的细胞来源一直以来是细胞治疗领域研究的焦点。脊髓背根神经节中的前体细胞是目前研究较少的一类细胞，前人研究提示这类细胞可能具有自我增殖和多向分化的潜能。然而对于其在脊髓损伤修复过程中的作用目前尚未见明确报道。
　　目的：体外实验中明确脊髓背根神经元前体细胞体外增殖特性及定向分化特征，建立大鼠脊髓损伤半切模型，为体内观察脊髓背根神经元前体细胞提供动物模型支持，继而评估脊髓背根神经元前体细胞在体增殖及分化情况，初步探究其对脊髓损伤后功能恢复的影响。
　　材料与方法：将出生1天的大鼠脊髓背根神经节取材后，通过双酶消化法获得单细胞悬液，在干细胞培养液的作用下，通过CCK-8试剂盒检测前体细胞吸光光度值来确定前体细胞的增殖特性。通过加入诱导分化试剂后检测前体细胞的分化方向，用免疫荧光的方法来研究该类细胞向神经系统各类细胞分化的比例。以重组腺相关病毒作为载体将前体细胞标记上绿色荧光蛋白后移植到脊髓半切损伤模型大鼠的损伤部位作为实验组，注射生理盐水作为对照组，细胞移植后1，4，6周通过BBB-21评分法来确定前体细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响，通过免疫荧光的方法研究前体细胞在脊髓中的迁移和分化。数据采用单因素方差进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义.
　　结果：在体外通过双酶消化法得到的单细胞悬液，经过控制纯化的条件得到高纯度的背根神经前体细胞。在干细胞培养液的作用下，前体细胞呈现干细胞特有的克隆团样增殖，通过CCK-8试剂盒检测前体细胞吸光光度值，证实前体细胞具有自我增殖的能力。通过加入诱导分化试剂刺激前体细胞进行分化，证实前体细胞主要向胶质细胞方向进行分化，仅有少部分细胞分化为神经元。在注入脊髓损伤模型后，实验组和对照组通过不同时间点BBB-21评分证实前体细胞移植组BBB-21评分明显高于生理盐水注射组，通过单因素方差分析再次证实两组之间具有明显的统计学意义(p＜0.05)。免疫荧光检测证实前体细胞与损伤处的神经细胞建立了广泛的关联。
　　结论：实验证实在体外背根神经节前体细胞在干细胞培养液的作用下表现出自我增殖的特性。在分化诱导试剂的作用下，主要向胶质细胞方向进行分化。在体内，重组腺病毒病毒标记前体细胞移植到大鼠脊髓半切损伤模型，证实前体细胞确实能在脊髓损伤部位存活，主要向神经胶质细胞分化，前体细胞与宿主的神经元建立广泛的突触联系，可以明显促进损伤运动神经功能修复。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 绪论

第二章 脊髓背根神经节的分离、培养、纯化、神经元鉴定及活性评价

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第三章 脊髓背根神经元前体细胞体外增殖特性评价及定向分化诱导方法建立

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第四章 大鼠脊髓损伤模型建立

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第五章 初步探究脊髓背根神经节前体细胞对脊髓损伤后功能恢复的影响

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第六章 结论

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表文章情况

致谢