负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用

摘要

脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)通常导致灾难性的神经功能缺损，传统治疗方法作用有限。随着对SCI免疫反应研究的深入，保护性自身免疫反应在SCI神经功能恢复中的作用引起关注。树突状细胞(dendriticcells，DCs)是专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcells，APC)，在幼稚T细胞的活化、免疫方向的调控甚至T细胞极性的转换等方面具有重要作用。已经证实，损伤局部注射负载髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)或其衍生肽的DCs可以促进SCI后神经功能恢复。但MBP成分单一，制备较困难，不利于临床推广且作用有限；局部注射需要显露椎管，操作复杂，损伤大。脊髓匀浆蛋(homogenateproteinofspinalcord，hp)理论上包含SCI局部所有的可能抗原成分，更为接近体内真实环境，且制备简单，便于临床使用；腹腔注射操作简单，损伤小。本文旨在探讨负载脊髓匀浆蛋白的DCs(dendriticcellspulsedwithhomogenateproteinofspinalcord，hpDCs)能否促进SCI神经功能恢复以及腹腔注射的效果和局部注射是否有差别。 材料与方法： 1.制作小鼠SCI模型。 成年BALB/c小鼠，使用显微外科动脉夹制作T10节段重度钳夹伤SCI模型。 2.制备小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs。 3.实验干预及分组。实验动物分3组，伤后1天，BBB评分＜2分者，分别局部或腹腔注射hp(局部：40μg/5μL；腹腔：40μg/0.3mL)、DCs(局部：1×106cells/5μL；腹腔：1×106cells/0.3mL)或hpDCs(局部：1×106cells/5μL；腹腔：1×106cells/0.3mL)。 4.各动物每周进行BBB评分，观察神经功能恢复情况。 5.注射后28、56、84天(dayspostinjection，dpi)，左心室灌注固定后取材，HE染色观察局部病变情况，测量脊髓损伤区长度。 6.免疫组织化学染色(IHC)与免疫荧光组织化学双标法观察损伤后GFAP、Nestin、NF在损伤区表达情况，测量胶质瘢痕厚度。 7.脊髓损伤大鼠在84dpi行生物素化葡聚糖胺(biotinylateddextranamine，BDA)轴突顺行示踪，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)轴突逆行示踪，结合IHC检测胶质瘢痕与轴突、囊腔的关系。 结果： 1.各组小鼠在伤后均出现完全性截瘫，1w左右BBB评分逐渐恢复。其中，hpDCs组小鼠恢复最快，于28dpi进入平台期，BBB评分高达14.0±2.0，最终达到16.3±2.1，显著高于DCs组(10.0±2.0)和hp组(10.4±1.8)(p＜0.01)。腹腔注射和局部注射BBB评分结果无统计学差异。 2.HE染色显示各组损伤局部均出现反应性胶质瘢痕增生，空洞形成。但是，hpDCs组损伤局部空洞范围与DCs、hp组比较具有显著统计学差异(p＜0.01)，损伤范围及胶质瘢痕厚度与DCs组具有统计学差异(p＜0.0s)。 3.IHC染色发现，脊髓损伤的囊腔周围GFAP+表达的星形胶质细胞肥大增生，突起丰富，构成胶质瘢痕的主要成分。与其它二组相比，hpDCs组GFAP表达出现较慢，且GFAP+细胞分布较稀疏；hpDCs组，Nestin+细胞在注射后56dpi仍可见，而其它二组在注射后28dpi基本消失；NF表达可以明确地观察到损伤后轴突分布的情况，各组无显著区别。 4.各组中，BDA顺行示踪与HRP逆行示踪观察到轴突终止于胶质瘢痕外，未到达囊腔内。 结论： 1.本实验制备的小鼠脊髓钳夹伤模型，造成脊髓严重不完全损伤，其病理过程和临床接近，能够模拟临床自然病程，符合实验要求。 2.局部或腹腔注射hpDCs，能够显著促进小鼠SCI神经功能恢复，而hp具有相对较弱的促进作用，单纯DCs效果最差。 3.腹腔注射和局部注射具有同样效果，表明hpDCs是通过全身性的系统免疫起作用。 4.hpDCs可以延缓局部胶质瘢痕形成，降低胶质瘢痕密度和厚度，缩小局部空洞及损伤部位面积，提示可以降低胶质瘢痕对神经再生的屏障作用；可以延长局部Nestin表达，提示可以增加局部存在的内源性再生能力。 5.免疫组织化学荧光双标技术及神经纤维示踪技术证实hpDCs不能够使轴突穿过胶质瘢痕。 6.hpDCs较单纯DCs或hp效果好，表明局部DCs效应不足，或者与抗原结合能力受限。 综上所述，本文通过小鼠脊髓钳夹伤的神经功能评价、病理学及免疫学研究，发现负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞可以促进SCI后神经功能恢复，并能够改善局部组织结构。腹腔使用和局部使用具有同样效果。脊髓匀浆蛋白制备技术简单，周期短，便于开展临床研究，为进一步研究提供了实验依据。

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