核基质结合区（MAR）调控的胰岛素样生长因子-1表达载体构建与转化甘蓝的研究

摘要

本项目根据甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)基因密码偏爱性,对IGF-1基因DNA序列进行了修改,根据优化的序列,人工半合成了该基因.同时从烟草(Nicotiana tabacum L.)和甘蓝中各克隆了一段MAR分子,通过转基因测定分析,两段MARs均能显著提高转基因表达水平,因此,被用于构建IGF-1高效植物表达载体,并首次将IGF-1基因导入甘蓝,成功获得了IGF-1转基因甘蓝新材料,为将甘蓝开发成一种具有治疗作用的药用蔬菜开辟了道路.研究工作主要包括以下几个方面:1核基质结合区(Matrix attachment regions,MARs)的分离核基质结合区(MAR)是能将染色质固定在核基质上(即能与核基质特异性结合)的一段DNA序列,长度通常为300~1000 bp,广泛分布于真核生物基因组中,并将真核基因组在结构和功能上分成相对独立的loop单位.MAR不仅使染色质形成了环形结构,还能作为DNA复制的起点,并能调节真核细胞中的基因表达.2 GUS表达载体的构建为了分析和比较不同来源的MARs对转基因表达的效果,本实验构建了以CaMV 35S为启动子,T-NOS为终止子,携带了MAR的和不携带MAR的GUS表达载体.3 GUS转基因烟草的获得及活性测定4胰岛素样生长因子-1基因的设计与合成根据甘蓝基因同义密码子相对使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU),选择高频使用密码子,对IGF-1基因DNA序列进行了优化.5 IGF-1表达载体的构建通过BamH Ⅰ/Sac Ⅰ酶切及连接,用IGF-1替换掉pBGUS中的GUS基因,得到中间表达载体pBIGFI.依次将烟草MAR插入pBIGFI表达框两侧的EcoR Ⅰ位点和HindⅢ位点,单酶切后的载体,连接之前都进行去磷酸化处理,以防自连.插入后用PCR方法选抒MARs在表达框两侧成同向排列的重组质粒,阳性克隆命名为pBMIGFIM1(MAR-P35S-IGF-1-TNOS-MAR).用同样的方法,顺序将甘蓝MAR插入质粒pBIGFI表达盒两翼的HindⅢ位点和EcoR Ⅰ位点,选择MARs方向相同的重组质粒,阳性克隆命名为pBMIGFIM2.6甘蓝再生-转化体系的建立为了测定外植体对卡那霉素(kanamycin,kan.)敏感性,在筛选出的最佳诱导培养基中附加不同浓度kan.(1、2.5、5、 7.5、10、15、20mg/L),对下胚轴外植体进行培养,结果5mg/Lkan.即可有效抑制甘蓝下胚轴芽分化,此浓度用作转基因甘蓝抗性芽的筛选浓度.7IGF-1基因转化甘蓝及转基因植株的检测采用农杆菌介导法,将携带了MARs的两个IGF-1表达载体pBMIGFIM1和pBMIGFIM2导入甘蓝中,转化程序为:甘蓝下胚轴外植体在分化培养基中预培养2d,用根癌农杆菌侵染后黑暗条件下共培养2d,再进行抑菌培养6d,转人筛选培养基(MS+3mg/L BA+0.1mg/L NAA+5mg/L Kan.+250mg/L Cb.)中培养.

目录

文摘

英文文摘

第1章文献综述

1.1胰岛素样生长因子-1的基础与临床应用研究进展

1.1.1 IGFs的发现

1.1.2血清中IGF-1概况

1.1.3 IGF-1的生物学特性

1.1.4IGF-1的影响因素

1.1.5 IGF-1与临床

1.1.6重组IGF-1研究进展

1.1.7IGF-1临床应用前景

1.2核基质结合区(Matrix attachment region，MAR)研究状况

1.2.1核基质结合区的发现

1.2.2核基质结合区的结构特点

1.2.3核基质结合区的功能

1.2.4核基质结合区对转基因表达的影响

1.3甘蓝研究状况

第2章引言

2.1研究的目的和意义

2.2研究的内容及技术路线

2.3本项目的创新点

第3章核基质结合区(MAR)的克隆及其功能鉴定

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1 MARs克隆

3.2.2 GUS表达载体的构建结果

3.2.3 GUS转基因烟草的获得及表达活性测定

3.3讨论

第4章胰岛素样生长因子-1基因(IGF-1)的合成及MAR调控的表达载体构建

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2实验方法

4.2结果与分析

4.2.1IGF-1基因的合成结果

4.2.2携带MARs的IGF-1表达载体构建

4.3讨论

第5章MAR调控的胰岛素样生长因子-1基因转化甘蓝

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2实验方法

5.2结果与分析

5.2.1甘蓝离体再生体系的建立

5.2.2甘蓝下胚轴芽分化对抗生素的敏感性

5.2.3甘蓝转基因植株的获得

5.2.4甘蓝转基因植株的检测

5.3讨论

第6章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢

发表论文及参加课题一览表

缩写词

附图

附录