杜氏盐藻核基质结合区的分离及其对转基因的表达调控作用

摘要

本研究中，我们以杜氏盐藻为材料进行了MAR的分离与功能性研究。首先用二碘水杨酸锂盐(LIS)抽提杜氏盐藻细胞核制备了盐藻核基质，限制酶充分消化，SDS-蛋白酶K提取杜氏盐藻核基质结合区DNA，连接至pUC18载体上构建了杜氏盐藻随机MAR文库，蓝白斑筛选出56个阳性菌落。体外结合实验筛选从构建的杜氏盐藻随机MAR文库中筛选出3个能与核基质结合的DNA片段，其中2个片段结合能力较强。测序分析3个DNA片段具有典型的MAR特征，富含AT，具备A-box，T-box等一些典型的特征。将分离的MAR片段作为调控元件构建到包含氯霉素乙酰转移酶报告基因(CAT)表达载体pRNC表达盒的两侧，与含bar基因的表达载体pSP-B1电击共转化杜氏盐藻细胞，草丁膦(PPT)进行抗性筛选，获得了稳定转化的杜氏盐藻藻株。采用ELISA方法检测报告基因CAT酶活性，结果证实分离的3个MAR片段能分别提高报告基因CAT酶活性1.5倍，4.5倍及2.2倍。Southernblotting证实转化的CAT基因已经整合到转化的杜氏盐藻基因组DNA上。Northernblotting分析证实CAT报告基因能在RNA水平进行转录与表达。 结论：1、首次从单细胞的杜氏盐藻中分离出了3个MAR片段，其特征符合一般生物MAR的基本特征。如富含AT、具备一些特征性基序。2、CAT报告基因能在杜氏盐藻中表达。3、分离的MAR能提高报告基因CAT在稳定转化杜氏盐藻中的表达水平。4、MAR的促进效应与其在体外与核基质的结合能力并不呈相关性。5、含MAR表达载体转化的杜氏盐藻CAT基因已经稳定整合到转化杜氏藻株的基因组中。6、含MAR表达载体转化的杜氏盐藻CAT基因能在RNA水平正常转录和表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：资助

郑重声明

引言

第一部分杜氏盐藻核基质结合区的分离及其特征性分析

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第二部分杜氏盐藻核基质结合区对转基因的表达调控作用

前 言

材料与方法

1试验材料

2试验方法

结 果

1杜氏盐藻MAR的PCR扩增

2表达载体pRNC的构建

3含MAR系列表达载体pcDMM的构建

4pcDMM表达载体转化盐藻及其转化子的筛选

5bar基因与CAT基因不同摩尔比与含选择标记bar基因共转化的频率的关系

6转化盐藻株的CAT酶活性分析结果

7PCR鉴定及Southern blottinfg结果

讨 论

结 论

参考文献

综述：核基质结合区及转基因盐藻研究进展

1MAR的分离

2MAR的分子结构特征

3MAR序列对转基因表达的影响

4MAR的作用分子机制

5转基因盐藻研究进展

6存在问题和展望

参考文献

英文缩略词

附录1攻读学位期间获得的基金及发表的论文

附录2 GenBank登录的盐藻MARDSM1序列及测序彩图

附录3 GenBank登录的盐藻MARDSM2序列及测序彩图

附录4 GenBank登录的盐藻MARDSM3序列及测序彩图

附录5转基因盐藻CATPCR扩增测序彩图

致谢