活血化瘀方对溶血磷脂酸诱导VSMCs增殖及信号转导机制研究

摘要

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic Acid,LPA),作为心血管活性物质,与动脉粥样硬化、心肌梗塞、高血压等病症密切相关,在心血管系统中具有重要作用。临床研究发现,血清LPA的含量与急性心梗的发病密切相关。急性心肌梗死患者发病8h后,血清LPA水平可升高2倍以上；发病48-72h,可高达正常人的6倍；急性心肌梗死7d后仍高于正常水平。LPA能够促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移和去分化,最终导致血管腔狭窄。
　　 目前血管再狭窄的确切发病机制虽未完全阐明。但基于现有多项基础和临床研究结果,认为其发生机理主要包括新生内膜过度增生、血管弹性回缩、损伤部位血栓形成及负性血管重构等。其中血管内膜增生是产生再狭窄的主要因为,而血管平滑肌细胞(vascular smooth musele cell,VSMC)的过度增生是内膜增生的主要机制。抑制VSMCs的过度增生成为防治再狭窄的关键。
　　 中药血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊一为传统活血化瘀名方血府逐瘀汤的新型制剂,一为以活血化瘀中药三七有效成分三七总皂苷为主要成分的现代中药。两者作为活血化瘀中药的代表,临床上广泛应用于心肌梗死及心肌梗死介入后的干预治疗,疗效显著。但活血化瘀中药对再狭窄主要因为VSMCs增殖的防治作用及作用的信号转导机制研究报道较少。本研究运用血清药理学的方法观察了两种活血化瘀中药对正常及LPA模拟的心肌梗死后血管内环境下VSMCs增殖的影响,并探讨了其发挥作用的可能信号转导机制,以期为活血化瘀中药在防治再狭窄中的应用提供可靠的理论依据,也为防治再狭窄中药的开发提供有效而合理的靶点,使中药成为防治再狭窄的一条可靠途径。
　　 本研究论文主要分为两部分:文献综述、实验研究。
　　 1.文献综述:本部分分别从溶血磷脂酸与心血管系统研究进展、再狭窄机制的研究现状、中药及其有效成分干预再狭窄研究进展三个方面对本研究依托的研究基础进行了综述。
　　 2.实验研究:包括以下五个基础实验。
　　 2.1干预血清的制备
　　 采用中药血清药理研究的通用给药方案:即SD大鼠每日给药2次,连续给药3天,末次给药1小时后采血,离心后获取血清。给药剂量为等效剂量的10倍,弥补含药血清被稀释可能给实验带来的影响。MTT法确定细胞培养液中血清的干预浓度为10％为宜。
　　 2.2大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定
　　 运用组织贴块法原代培养SD大鼠主动脉VSMCs,鉴定方法:倒置相差显微镜下观察细胞的形态学特征并用a-actin免疫细胞化学染色法进行鉴定。结果:组织块接种于培养瓶内5—7天,可见细胞从组织块边缘爬出,呈典型的“峰谷样”生长,平滑肌a-actin免疫细胞化学染色后,大于90％的细胞染色呈阳性,即细胞浆内呈现棕黄色,胞核不着色,表明细胞含有平滑肌肌动蛋白,证实为平滑肌细胞。
　　 2.3活血化瘀方含药血清对血管平滑肌细胞增殖的影响
　　 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察不同分组对细胞增殖的影响。使用不同的含药血清干预体外培养的VSMCs,加入LPA模拟心肌梗死后的血管内环境,并运用信号转导干预剂PD98059(细胞外信号调节激酶ERK1/2抑制剂)、百日咳毒素PTX(G蛋白偶联受体拮抗剂)、H7(蛋白激酶C抑制剂)、PMA(蛋白激酶C激动剂佛波酯)对不同信号转导通路进行干预,观察血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对正常VSMCs增殖的影响,对LPA诱导的VSMCs增殖的影响,以及加入信号转导干预剂后的变化,探讨其发挥作用的可能信号转导通路。实验共分12组:空白血清组；血府逐瘀胶囊含药血清组；血塞通胶囊含药血清组；空白血清+LPA组；血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组；血塞通胶囊含药血清+LPA组；血塞通胶囊含药血清+LPA+PD98059组；血塞通胶囊含药血清+LPA+PTX组；血塞通胶囊含药血清+LPA+PMA组；血塞通胶囊含药血清+LPA+H7组；卡托普利含药血清+LPA组；血府逐瘀胶囊含药血清+LPA+PD98059组。血清干预24小时,MTT法检测细胞活性。结果:与空白血清组比较血府逐瘀胶囊含药血清组OD值升高(P<0.05),空白血清+LPA组OD值升高(P<0.01),血塞通胶囊含药血清组OD值与之无统计学差异；血府逐瘀胶囊含药血清,血塞通胶囊含药血清加入LPA后OD值的升高较之空白血清明显减小(P<0.05),空白血清+LPA组、血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组、卡托普利含药血清+LPA组三组间OD值无统计学差异,血塞通胶囊含药血清+LPA组OD值较之减小(P<0.05)；较之血塞通胶囊含药血清+LPA组,血塞通胶囊含药血清+LPA+PD98059组、血塞通胶囊含药血清+LPA+PTX组、血塞通胶囊含药血清+LPA+H7组OD值降低(P<0.05),血塞通胶囊含药血清+LPA+PMA组OD值升高(P<0.05)。血府逐瘀胶囊含药血清+LPA+PD98059组较血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组OD值降低(P<0.05)。
　　 2.4活血化瘀方含药血清对血管平滑肌细胞周期分布的影响
　　 采用PI染色法使用流式细胞仪根据DNA含量检测S期指数,分析不同分组对细胞周期分布的影响。实验分组同2.3,干预24h后,收集细胞,按照PI染色流程染色后,上机检测,读取细胞周期中的S期指数。结果:与空白血清组比较空白血清+LPA组、血府逐瘀胶囊含药血清组SPF升高(P<0.05),血塞通胶囊含药血清组SPF升高但(P>0.05)；血府逐瘀胶囊含药血清,血塞通胶囊含药血清加入LPA后SPF的升高较之空白血清明显减小(P<0.05)；与空白血清+LPA.组比较,血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组SPF升高(P<0.05),血塞通胶囊含药血清+LPA组、卡托普利含药血清+LPA组SPF降低(P<0.05)；较之血塞通胶囊含药血清+LPA组,血塞通胶囊含药血清+LPA+PD98059组、血塞通胶囊含药血清+LPA+PTX组、血塞通胶囊含药血清+LPA+H7组SPF降低(P<0.05),血塞通胶囊含药血清+LPA+PMA组SPF升高(P<0.05)；血府逐瘀胶囊含药血清+LPA+PD98059组较血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组SPF降低(P<0.05)。
　　 2.5活血化瘀方含药血清对细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2活性的影响
　　 免疫印迹法(Western Bloting)检测ERK1/2及p-ERK1/2的表达,通过p-ERK1/2的相对水平反应不同分组ERK1/2活化程度的变化。实验分组同2.3,干预24h后,收集细胞,提取蛋白,经凝胶电泳,一抗、二抗孵育后根据p-ERK、ERK1/2的表达量计算ERK1/2的活化程度。结果:血府逐瘀胶囊含药血清组、血塞通胶囊含药血清组、空白血清+LPA组较空白血清组Erk1/2活性增强(P<0.05)；较之空白血清,血府逐瘀胶囊含药血清,血塞通胶囊含药血清加入LPA后ERK的活化明显受到抑制(P<0.05)；与空白血清+LPA组比较,血府逐瘀胶囊含药血清+LPA.组,血塞通胶囊含药血清+LPA组、卡托普利含药血清+LPA组ERK活性降低(P<0.05)；与血塞通胶囊含药血清+LPA组比较血塞通胶囊含药血清+LPA+PD98059组、血塞通胶囊含药血清+LPA+PTX组、血塞通胶囊含药血清+LPA+H7组抑制了ERK的活化(P<0.05):较之血府逐瘀胶囊含药血清+LPA组,血府逐瘀胶囊含药血清+LPA+PD98059组ERK活性降低(P<0.05)。
　　 综上所述,本实验结果显示:心肌梗死后LPA浓度的升高,确实促进了VSMCs的增殖,为导致再狭窄的因素之一。血塞通胶囊对正常VSMCs无特殊作用,而血府逐瘀胶囊对正常VSMCs则表现为促增殖作用。对于LPA诱导的VSMCs增殖,血塞通胶囊、血府逐瘀胶囊均有抑制作用。活血化瘀中药通过抑制LPA诱导的ERK1/2的过度活化及抑制VSMCs向S期的转化发挥其防治再狭窄的作用。心肌梗死后VSMCs增殖的信号转导机制可能是G蛋白偶联受体-PKC-MEK1/2-ERK1/2,即LPA与VSMCs细胞膜上的受体结合后,通过膜表面G蛋白偶联受体和肌醇磷脂系统激活蛋白激酶C,再通过Ras-Raf通路激活MAPK(ERK1/2),活化的MAPK进入核内激活一系列生长相关基因表达,引起细胞增殖。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

第一部分 文献综述

综述一 溶血磷脂酸与心血管系统研究进展

综述二 再狭窄机制的研究现状

综述三 中药及其有效成分干预再狭窄研究进展

第二部分 实验研究

实验一 干预血清的制备

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二 大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验三 活血化瘀方含药血清对血管平滑肌细胞增殖的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验四 活血化瘀方含药血清对血管平滑肌细胞周期分布的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

附图

实验五活 血化瘀方含药血清对细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2活性的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

结语

致谢

个人简历