复方苦参注射液干预BMSCs与乳腺癌细胞交互作用机理的体外实验研究

摘要

流行病学显示：在中国，每年乳腺癌的发病率增加3％。是世界上癌症的最高增幅，中国首个大规模乳腺癌流行病调研项目“中国乳腺癌流行病学调研项目”中国女性乳腺癌患者的发病年龄跨度从20岁到70余岁，其中40岁到49岁年龄段是发病高峰期，发病的中位年龄为48岁，比西方提早了十年。乳腺癌的复发和转移，这也是目前乳腺癌治疗中的难题之一。然而关于发生复发和转移的原因和机制却仍旧很不明晰，同时这一现状也提示我们对于乳腺癌的治疗当有新的研究角度和方法的提出。
　　在过去的25年中，由于过度夸大的肿瘤遗传学-特别是癌基因和抑癌基因的作用，形成了以肿瘤细胞为中心的概念，肿瘤基质细胞和肿瘤免疫细胞等被人逐渐忽视，因此不能全面的理解肿瘤细胞的生物学特征。经过十多年的互相质疑，肿瘤研究者逐渐形成了一种历史性的重要的一致性看法，即肿瘤间质细胞为主体及其构建的肿瘤炎性微环境会激发并促进肿瘤的发生和发展。同时肿瘤的炎症微环境也积极促进肿瘤的进展。
　　骨髓间充质干细胞是来源于骨髓的多能干细胞，在机体发生创伤和炎症时，该种细胞受趋化因子的驱动会趋化到机体炎性局部，积极参与机体的修复。肿瘤被称为永不停息的炎症，该类细胞近年被证实是肿瘤炎症微环境中重要的间质细胞之一，其可通过旁分泌途径分泌趋化因子并与肿瘤表面的受体结合，同时激活下游癌基因通路，导致肿瘤恶性增殖，侵袭和转移能力的增加，最终导致恶性肿瘤的复发和转移。
　　在乳腺癌发生复发转移时表现为病情的进展，而此时毒热壅盛是其进展期常见证型之一，同时也是肿瘤内部炎症微环境的外在表现，此时当以清热解毒法来治疗。复方苦参注射液是常用的具有清热解毒功效的中药注射液，我们采用其作为干预手段，以肿瘤炎症微环境中的重要间质细胞骨髓间充质干细胞为研究对象，以调控其与乳腺癌细胞交互作用的趋化因子轴线及其下游基因的激活情况为目的，观察苦参注射液对骨髓间充质干细胞促乳腺癌恶性行为的干预作用。本课题研究主要包括如下内容。
　　1不同来源的骨髓间充质干细胞体外纯化、鉴定及多能性比较
　　骨髓间充质干细胞是来源于骨髓的多能干细胞，可分化为多种组织细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。可经体外诱导分化而进一步体内移植生长，在组织工程中应用广泛。我们通过文献综述，选择了可获得良好细胞活力的差速贴壁发来分别从SD大鼠和Ba1b/c小鼠的骨髓中获取了不同鼠源的骨髓间充质干细胞，通过生长曲线、诱导成骨和成脂分化、流式细胞术鉴别细胞表型来对细胞进行了鉴定和比较，最终认为SD大鼠的骨髓间充质干细胞具有更好的细胞活性和多能性，选择其为下一步实验的细胞来源。
　　2复方苦参注射液干预骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境中表型分化
　　干细胞的研究可能治愈临床近80％的疾病，但就肿瘤和感染性疾病的治疗仍就是其治疗的盲区，同时其在组织工程应用中的安全性问题(突变为肿瘤细胞)仍就是其研究领域的重要障碍之一，同时也为肿瘤干细胞理论提供了最直接的证据。因此研究成体干细胞与肿瘤的关系是目前国内外研究中的重点之一。近期发现骨髓间充质干细胞在乳腺癌的发病、复发和转移中起到了重要作用，但仍有争议，研究前沿认为肿瘤作为永不停息的炎症，与机体损伤后修复等炎性反应等有很大类似，骨髓间充质干细胞会受肿瘤炎性趋化因子梯度趋化到肿瘤间质中，并在肿瘤炎性微环境中分化为具有肿瘤成纤维细胞表型的细胞，持续分泌SDF-1等趋化因子，并与肿瘤表面的CXCR4受体结合，通过旁分泌的途径激活下游癌基因，从而促进肿瘤的发生，恶性增殖、血管新生，最终也会导致肿瘤的复发和转移。我们通过肿瘤条件培养液来模拟肿瘤炎性微环境，观察骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境中表型的变化，来验证以上病理变化的发生。
　　3复方苦参注射液对BMSCs与乳腺癌细胞间趋化因子轴线影响的体外实验研究
　　选取对于炎症反应具有较好抑制作用，在临床广泛应用的复方苦参注射液来作为干预手段，以BMSCs与乳腺癌4T1细胞交互作用的重要趋化因子轴线SDF-1/CXCR4为观察靶点，在体外分别采用单独干预和Transwell共培养体系来观察在两者交互作用时SDF-1/CXCR4动态变化。
　　4复方苦参注射液对BMSCs促乳腺癌恶性行为影响的体外实验研究
　　采用Transwell共培养体系观察共培养情况下，BMSCs对乳腺癌4T1细胞系的增殖的影响，采用Transwell迁徙小室来观察；条件培养液和共培养情况下，观察BMSCs向4T1细胞迁移情况，采用Transwell侵袭小室来观察，条件培养液和共培养情况下，观察4T1乳腺癌细胞侵袭能力的变化。采用了mRNAarray的实验方法，选取了与肿瘤恶性增殖、侵袭、粘附、凋亡、ECM相关等恶性行为高度相关的90个基因为检测目标，对苦参对体系的干预作用进行了初步的研究。
　　结论:
　　综上本实验得出以下结论：
　　1在本实验室成功建立了骨髓间充质干细胞分离，纯化及鉴定的平台，并比较了不同来源骨髓间充质的特性，为实验的开展提供良好的细胞来源。
　　2分别观察了复方苦参注射液对正常骨髓间充质细胞和乳腺癌4T1细胞在抑制率、诱导凋亡影响的差异性，最终发现在具有抑制肿瘤细胞和诱导凋亡的相同浓度下，复方苦参注射液对正常的骨髓间充质干细胞并未表现出明显影响，提示具有此特性的复方苦参注射液是理想的长期干预药物。同时和化疗药DDP的对比也提示我们，复方苦参注射液在低浓度的干预条件下可能并不是完全通过对肿瘤的直接抑制而起到抗复发转移的作用。
　　3在肿瘤微环境情况下，骨髓间充质干细胞的表型发生了变化，免疫荧光结果显示其特异性蛋白表达量和强度随着干预时间增加而不断增强。采用复方苦参注射液干预后发现，可抑制骨髓间充质干细胞向肿瘤相关成纤维细胞表型的变化。
　　4不同浓度苦参注射液干预后，在常氧和低氧条件下其均可降低乳腺癌4T1细胞表面CXCR4受体的表达，同时在低氧环境下骨髓间充质干细胞促乳腺癌4T1细胞增殖能力强于常氧环境，低氧环境下骨髓问充质干细胞向乳腺癌4T1细胞的迁移能力较常氧环境增加。苦参对以上环节均有一定的抑制作用。同时发现在低氧共培养48h条件下，复方苦参注射液可明显降低细胞共培养上清中的SDF-1的浓度，并影响两者细胞之间的互相迁移。(P>0.05)
　　5共培养后乳腺癌恶性行为增加，表现在低氧环境下在BMSCs条件培养液中的增殖能力增强，共培养低氧环境下侵袭能力增强。采用mRNAarray基因检测后，发现在共培养的条件下相关恶性行为的基因上调，在基因层面为我们解释了这一行为的可能原因之一。在用复方苦参注射液干预后发现由MDSCs造成的乳腺癌增加的恶性行为表现受到一定程度的抑制，同时在基因层面也表现为相关基因型受抑制，主要表现在侵袭等恶性行为相关的基因明显受抑，虽然也出现了部分癌基因的上调，但最终的实验结果和长期临床干预的证据说明其是安全并具有良好抗肿瘤复发转移作用的药物。同时实验结果也提示我们中药注射液的多成分形成了其多靶点的同时，也可能具有双向性，因此我们认为只有在中医理论指导下规范的使用，才可能是临床使用注射剂达到低毒高效的准则。但同时其科学内涵仍待近一步的实验及临床研究证实。