益气活血降浊方对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究

摘要

1研究背景：
　　肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同表现和主要病理基础。其病理改变主要是肾小管萎缩、炎症细胞浸润和过多的纤维成分在肾小管间质广泛沉积，它以过量细胞外基质(ECM)如胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型、纤维连接蛋白和层连蛋白在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。其特征为结缔组织沉积于肾实质损伤肾脏。其核心是肾小管上皮细胞间质转分化(EMT)，EMT是肾小管肾细胞失去上皮细胞表型特征并表现出转型能力，并生成细胞外基质的过程。肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)大量活化、增殖是RIF的关键环节，肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，简称EMT)在RIF的发生、发展过程中发挥重要作用，因此，抑制EMT可以有效延缓甚至逆转肾小管纤维化过程。但是，针对这一关键病理环节，目前尚无有效的治疗方法。中医药治疗慢性肾纤维化具有疗效好、副作用小的优势。因此，深入研究中医益气活血降浊方对EMT的作用对中医药防治肾纤维化有重要意义。
　　中医认为，本病的病机以脾肾亏虚为本，湿瘀互阻为标。治疗以扶正祛邪，标本兼治，治则为益气活血，利湿降浊。以戴希文为首的老一辈肾病专家通过对大量CRF病例观察研究出以益气活血降浊法为主的益肾降压方(生黄芪、当归、川芎、赤芍、大黄等)。前期临床研究发现该方确能延缓慢性肾衰竭的进展，改善病人生活质量，减少终点事件发生。基础研究发现益气活血法可以通过降低TGF-β1、提高smad6、7的表达；恢复基质金属蛋白酶及其抑制因子间的平衡；减少细胞外基质的异常积聚减轻或抑制了肾纤维化进程，有效延缓肾衰大鼠进行性的肾功能损害。
　　2研究目的：
　　通过信号转导通路TGF-β1/smads、p38MAPK、Rho-ROCK等途径研究益气活血法对EMT抑制作用的分子机制，来阐明益气活血法防治肾纤维化的作用机制，寻找益气活血法防治肾纤维化的作用的具体靶点和不同剂量对治疗的差异，找出肾纤维化最佳的治疗方案，为中医治疗肾纤维化以及慢性肾功能衰竭奠定较为坚实的理论基础。
　　3研究内容与方法：
　　本实验在前期研究基础上，从整体、细胞、基因水平、信号转导途径，利用细胞培养的体外试验，应用电镜、免疫组化、RT-PCR、Western-blot等技术，多层次探讨益气活血法防治肾纤维化的作用机制和具体靶点，为中医药治疗肾纤维化和慢性肾衰竭提供科学依据。
　　4结果：
　　4.1细胞形态学方面
　　中药含药血清有逆转TGF-β1刺激HK-2细胞EMT的趋势，以含药血清大剂量组为效果最为明显。
　　4.2调控蛋白表达方面
　　首先，益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA的表达，并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达；其次，该方可明显抑制TGF/smads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达从而抑制EMT进程。
　　4.3细胞因子方面
　　益气活血降浊方可以通过调节与肾小管上皮细胞中与EMT相关的细胞因子TGF-β1、HGF、BMP-7、ILK、CTGF、Ⅰ型胶原的表达，来干预肾小管上皮细胞的EMT进程。
　　4.4调控DNA表达方面
　　调控rhoA和p38基因的表达未发现明显改变，但中药中剂量组对p38 MAPK基因的表达可能有抑制作用。
　　5结论：
　　益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA的表达，抑制TGF/smads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达，抑制与EMT相关的细胞因子TGF-β1、ILK、CTGF、Ⅰ型胶原的表达，并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达，提高与抑制EMT有关的细胞因子HGF、BMP-7的表达，从而抑制EMT进程发挥抗肾小管间质纤维化作用。