差异基因白介素-8在冠心病血瘀证发病过程中的作用研究

摘要

本课题组前期应用寡核苷酸基因芯片技术构建了冠心病血瘀证差异基因表达谱，研究结果筛选出IL-8(白介素-8)、FcγRⅢA(免疫球蛋白IgG结晶片段受体Ⅲa)、PKCβ1（蛋白激酶Cβ1）、HLA-DQB1（主要组织相容性复合体Ⅱβ1）、FOLR3（叶酸受体γ3）、PTGDS（前列腺素D2合成酶）等6个目标基因。继而采用基因本体论和显著性通路的分析方法，从分子水平揭示了冠心病血瘀证与炎症免疫反应的相关性，并通过网络拓扑技术分析研究发现差异基因IL-8、FcγRⅢA和PKCβ1在冠心病血瘀证疾病网络中处于关键调控环节。前期研究还发现FcγRⅢA通过介导单核细胞与内皮细胞粘附，影响动脉粥样硬化斑块稳定性从而参与冠心病血瘀证的演变;而对趋化因子IL-8初步研究发现其具有诱导血小板活化的作用，并能协同花生四烯酸和二磷酸腺苷诱导血小板活化，可能是IL-8参与冠心病血瘀证形成的机制之一。
　　 本课题在以往研究基础上对冠心病血瘀证差异基因IL-8进行进一步的临床验证，并对IL-8在冠心病血瘀证形成中的作用进行深入研究分析，结果发现冠心病血瘀证血清IL-8水平明显升高，从蛋白水平证实了IL-8与冠心病血瘀证的相关性。同时研究发现冠心病血瘀证患者的单核细胞血小板聚集率与中性粒细胞血小板聚集率均明显高于冠心病非血瘀证组。基于IL-8具有诱导白细胞膜表面粘附分子MAC-1活化的作用，而MAC-1在白细胞与血小板粘附聚集中发挥重要作用，那么在冠心病血证中白细胞聚集率的升高是否通过IL-8诱导MAC-1活化而发挥作用？本研究通过IL-8诱导外周血中性粒细胞、单核细胞和血小板构建模型，结果发现IL-8能够诱导外周血中性粒细胞和单核细胞聚集，也能够诱导MAC-1活化，且冠心病血瘀证组均明显高于非血瘀证和健康组，采用非选择性拮抗IL-8受体后，中性粒细胞、单核细胞聚集率和MAC-1活化水平均明显下降;同时发现IL-8诱导中性粒细胞血小板聚集和单核细胞血小板聚集后大量表达具有促凝活性的组织因子，并诱导其分泌具有活化血小板功能的组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶和血小板活化因子;研究还发现，IL-8除了诱导白细胞活化黏附血小板外，对血小板还有直接活化作用，IL-8受体CXCR1在血小板膜上中量表达，IL-8与该受体特异结合活化血小板，而Reparixin拮抗CXCR1后，血小板聚集率及血小板膜蛋白GPⅡ b/Ⅲa表达水平明显下降，就活血化瘀药物对上述生物过程的干预效应进行了研究，发现其具有一定的抑制效应。
　　 本课题研究分为两部分:文献综述和实验研究。
　　 1文献综述:本部分就冠心病血瘀证基因组及蛋白质组学研究进展以及IL-8在冠心病中作用两个方面进行综述。
　　 2实验研究:包括以下四个部分。
　　 研究一冠心病血瘀证患者白介素-8血清学水平及白细胞血小板聚集率测定
　　 目的:探讨冠心病血瘀证与IL-8血清水平、白细胞血小板聚集率及血小板膜蛋白GPⅡ b/Ⅲa表达水平的相关性。
　　 方法:冠心病诊断参照1999年美国心脏病学会(ACC)/美国心脏协会(AHA)/美国医师学会及美国内科学会(ACP-ASIM)联合协定关于《慢性稳定性心绞痛诊疗指南》、《不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死诊疗指南》。同时，参考中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证诊断标准。筛选符合冠心病、血瘀证、健康人入选标准的冠心病血瘀证组、冠心病非血瘀证组和健康对照组分别为53、49、45例为研究对象。冠心病血瘀证和非血瘀证患者于冠脉造影前采血，健康对照者于清晨空腹状态下抽取静脉血6mL，前2ml弃用，2ml采用流式细胞术检测白细胞血小板聚集率及血小板膜蛋白GPⅡ b/Ⅲa表达水平，另2ml应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-8血清水平。
　　 结果:冠心病血瘀证组、非血瘀证组和健康对照组在年龄、性别、体重指数且两疾病组在冠心病类型、冠脉病变支数、合并疾病和用药情况方面无显著性差异，具有可比性。
　　 ①冠心病IL-8血清水平较健康对照组(47.91±2.93)明显升高，且冠心病血瘀证组(72.58±4.12)较非血瘀证组(58.72±3.90)升高明显。
　　 ②冠心病血瘀证组(19.68±0.98)血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa表达水平较非血瘀证组(9.97±0.85)健康组(8.06±0.34)明显升高，而冠心病非血瘀证组较健康组仅有升高趋势。
　　 ③冠心病PLT-M聚集率和PLT-PMN聚集率较健康组(18.87±1.73)显著升高，冠心病血瘀证组(46.91±2.66)较非血瘀证组(31.56±3.17)有升高明显。
　　 结论:血清IL-8水平、血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa活性、单核细胞血小板聚集率、中性粒细胞血小板聚集率与冠心病血瘀证明显相关。
　　 研究二IL-8对单核细胞、中性粒细胞表面粘附分子及组织因子表达的影响
　　 目的:研究IL-8诱导白细胞血小板聚集机制，探讨IL-8参与冠心病及冠心病血瘀证的发病过程。
　　 方法:纳入冠心病血瘀证患者、冠心病非血瘀患者和健康志愿者各15例为研究对象，冠心病血瘀证和非血瘀证患者于冠脉造影前采血，健康志愿者于清晨空腹状态下抽取静脉血6 mL，前2ml弃用，置于EDTA抗凝真空采集管中。标本分为4组:空白对照组，35μl纯水;IL-8组，100ng/ml IL-8; Reparixin组，100ng/ml IL-8+1μMReparixin; fMLP组，1μM fMLP。37℃温育20min，加入0.5％的多聚甲醛固定2ml，2-8℃阴暗处放置30min，应用流式细胞术检测各组中性粒细胞和单核细胞的表面粘附分子MAC-1活化水平、血小板与中性粒细胞和单核细胞聚集率、血小板表面组织因子以及血小板与中性粒细胞和单核细胞形成聚集后组织因子的表达水平。
　　 结果:冠心病血瘀证组、非血瘀证组和健康对照组在年龄、性别、体重指数且两疾病组在冠心病类型、冠脉病变支数和合并疾病方面无显著性差异，具有可比性。
　　 ①IL-8诱导的粘附分子MAC-1在健康者单核细胞(8.26±2.23)和中性粒细胞(5.93±2.83)表面的表达水平均较空白对照组均明显升高，非选择性拮抗IL-8受体后，中性粒细胞(3.08±2.08)和单核细胞(4.9±1.79)表面的粘附分子MAC-1的表达水平均明显下降。
　　 ②冠心病组单核细胞和中性粒细胞表面粘附分子MAC-1表达水平较健康组明显升高，且冠心病血瘀证高于非血瘀证组(P＜0.05)。
　　 ③IL-8诱导的健康者PLT-PMN聚集率(22.85±3.57)和PLT-M(39.58±6.48)聚集率较空白对照组均明显升高;拮抗IL-8受体后，PLT-PMN(11.84±1.66)和PLT-M(25.41±3.23)聚集率均明显下降。
　　 ④冠心病组的PLT-PMN聚集率和PLT-M聚集率较健康组显著升高，且冠心病血瘀证组的PLT-PMN聚集率和PLT-M聚集率均显著高于非血瘀证组(P＜0.05)。
　　 ⑤IL-8诱导PLT-PMN聚集后组织因子表达检测结果提示，冠心病血瘀证组(34.96±6.15)高于非血瘀证组的表达水平(27.7±5.27)，且较同组血小板膜表面表达的组织因子升高更加明显。
　　 结论:
　　 ①IL-8可能通过活化中性粒细胞和单核细胞的粘附分子MAC-1促进其与血小板的聚集参与冠心病血瘀证形成。
　　 ②IL-8诱导血小板与中性粒细胞、单核细胞聚集后，促使其大量表达具有促凝活性的组织因子，可能是IL-8参与冠心病血瘀证形成的机制之一。
　　 研究三血小板膜IL-8受体CXCR1表达及功能分析
　　 目的:探讨IL-8对血小板的直接活化作用和活化机制。
　　 方法:以5例健康志愿者为研究对象，于清晨空腹状态下抽取静脉血5ml，分离血小板，应用去白细胞滤器纯化血小板，抽提总RNA，应用Real-time RT-PCR技术检测IL-8受体CXCR1基因表达水平;以15例健康志愿者为研究对象，于清晨空腹状态下抽取静脉血，制备PRP和PPP，采用比浊法检测血小板聚集率和流式细胞术检测血小板膜蛋白GPⅡ b/Ⅲa的表达。
　　 结果:
　　 ①血小板中CXCR1的相对表达量在1.22-2.37之间，呈中度表达，紫外分光光度计检测RNA纯度，质量符合Real-Time RT-PCR实验要求。
　　 ②低、中、高不同浓度IL-8对血小板聚集(7.85±1.03，12.56±1.68，19.93±1.52)均有一定的诱导作用，且呈剂量依赖，Reparixin阻断受体后血小板的聚集率明显下降(6.24±1.27)。
　　 ③低、中、高不同浓度IL-8刺激后，血小板膜蛋白CD62p的表达(15.46±1.58，28.57±1.64，42.09±2.87)均有不同程度增加，存在量效关系，Reparixin拮抗IL-8受体后，血小板膜蛋白CD62p的表达(17.04±1.98)显著降低。
　　 结论:
　　 ①趋化因子IL-8受体CXCR1在血小板膜表面呈中量表达。
　　 ②IL-8可通过与血小板膜表面受体CXCR1结合，从而直接活化血小板。
　　 研究四IL-8对人外周血中性粒细胞分泌的影响及活血化瘀中药干预效应的研究
　　 目的:研究IL-8对人外周血中性粒细胞分泌的影响及活血化瘀中药对其干预效应。
　　 方法:分离、鉴定并培养人外周血中性粒细胞，贴壁培养2h得到的中性粒细胞置于全RPMI1640培养基进行如下干预，空白对照组:35μl培养基;IL-8组:100ng/mlIL-8; Reparixin组:100ng/ml IL-8+25μl Reparixin; fMLP组:1μMfMLP;川芎嗪组:100ng/ml IL-8+20Lμl川芎嗪;芍药苷组:100ng/ml IL-8+20μl芍药苷。如上干预后各组中性粒细胞继续培养30min，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测各组Cathepsin G、NE和PAF含量。
　　 结果:
　　 ①重组细胞因子IL-8干预30min后中性粒细胞释放的Cathepsin G和NE较空白对照组显著升高(P＜0.01)。
　　 ②重组细胞因子IL-8干预30min后中性粒细胞释放的PAF较空白对照组明显升高，拮抗受体CXCR1后，PAF的释放水平明显下降。
　　 ③川芎嗪干预后，中性粒细胞释放的Cathepsin G和NE较IL-8组显著降低(P＜0.05);芍药苷干预后中性粒细胞释放的PAF明显降低(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 ①重组细胞因子IL-8在体外能刺激人外周中性粒细胞后分泌具有活性血小板和促凝活性的Cathepsin G、NE和PAF，拮抗受体表达后PAF等分泌水平下降。
　　 ②活血化瘀中药单体芍药苷和川芎嗪分别对重组细胞因子IL-8诱导中性粒细胞释放Cathepsin G、NE与PAF具有抑制作用，有类受体拮抗效应。

目录

声明

缩略词表

摘要

文献综述

第一部分 冠心病血瘀证基因及蛋白质组学研究进展

第二部分 白介素-8与冠心病

前言

第一部分 冠心病血瘀证患者白介素-8血清学水平及白细胞血小板聚集率测定

临床资料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 IL-8对人外周血单核细胞、中性粒细胞表面粘附分子及组织因子表达的影响

临床资料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 血小板上IL-8受体CXCR1表达及功能分析

资料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 IL-8对人外周血中性粒细胞分泌的影响及活血化瘀中药干预效应的研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文小结

创新点

致谢

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