肠安Ⅱ号方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导炎症后肠易激综合征(PI-IBS)大鼠肠粘膜免疫屏障的作用机制研究

摘要

研究背景：肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛、腹部不适伴有排便习惯改变、粪便性状异常为主要症状的功能性胃肠病，IBS发病机制复杂，与多种影响因素有关。随着感染后肠易激综合征(post-infectious irritablebowelsyndrome，PI-IBS)的提出，国内外研究越来越多，目前多认为胃肠感染后肠道存在低度炎症或无炎症，处于持续的免疫激活状态，致使出现IBS症状。经过近10年临床观察文献分析得出，目前西医主要是通过调节胃肠动力，改善肠道菌群为主的对症治疗，中医认为肝郁脾虚是基本病机，肝郁脾虚证是主要证型，痛泻要方及其加减方为主要治疗手段，并且临床疗效显著。本研究采用的肠安Ⅱ号方由痛泻要方加减，并加强了其益气安肠，温阳固涩的作用，前期研究发现肠安Ⅱ号方对IBS模型大鼠免疫功能具有显著的改善作用，而PI-IBS的主要疾病特点是肠道存在低度炎症、持续的免疫激活状态，因此采用肠安Ⅱ号方干预治疗PI-IBS，并且阐明其对PI-IBS的作用机理具有重要意义。
　　研究目的：通过对IBS近现代中西医治疗进展的论述和对中西医治疗IBS临床研究的文献分析，讨论目前存在问题及优点，为临床、科研提供参考;对肠安Ⅱ号方进行药效学实验，明确肠安Ⅱ号方的药理作用;采用新生母子分离+三硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激建立PI-IBS大鼠模型，给予肠安Ⅱ号方不同剂量进行干预，观察其疗效并研究其对PI-IBS大鼠肠粘膜免疫屏障的作用机制。
　　研究内容：
　　实验一、肠安Ⅱ号方对小鼠的药效学研究
　　目的:观察肠安Ⅱ号方的镇痛抗炎作用及其对胃肠动力和免疫功能的影响。
　　材料与方法:采用ICR小鼠小肠推进和新斯的明亢进实验来观察肠安Ⅱ号对胃肠动力是否有影响;采用热板镇痛法和二甲苯致小鼠耳肿胀实验来观察肠安Ⅱ号方是否有镇痛抗炎作用;以迟发性变态反应(DTH)、碳粒廓清指数测定的实验来观察其是否对免疫功能有影响。
　　结果:在小鼠小肠推进运动实验、新斯的明致小肠亢进实验中肠安Ⅱ号低、中、高剂量组推进率与正常组比较有显著差异(P＜0.01)，而3组间两两比较没有差异(P＞0.05);肠安Ⅱ号中、高剂量组的耳肿胀度与正常组相比有显著降低(P＜0.01)，低剂量组的肿胀度有所降低但无统计学意义(P=0.058＞0.05);在小鼠热板镇痛实验中，给药后60s肠安Ⅱ号中、高剂量组阈值与正常组比较，有显著性差异(P＜0.05)，给药后120s肠安Ⅱ号高剂量组阈值与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。迟发型变态反应实验中，肠安Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠耳肿胀度比模型对照组显著降低(P＜0.001)。肠安Ⅱ号低、中、高剂量组与空白对照组相比，有明显增强正常小鼠碳粒廓清指数的趋势，但未达到统计学意义(P＜0.05)。
　　实验二、肠安Ⅱ号方对TNBS诱导炎症后肠易激综合征(PI-IBS)大鼠肠粘膜屏障的作用机制研究
　　目的:本实验研究从机械屏障、免疫屏障、粘膜通透性三方面观察肠安Ⅱ号方对PI-IBS大鼠肠粘膜屏障的作用。主要从细胞免疫和体液免疫的调控来研究肠安Ⅱ号方对免疫屏障的作用机制，以CD4/CD8比值，IL-4/IL-1β比值，SIgA浆细胞活化程度，至分泌到肠腔的SIgA含量水平为观察指标，明确肠安Ⅱ号方对免疫屏障的作用机制。
　　材料与方法:采用新生母子分离+三硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激建立PI-IBS大鼠模型，实验动物分为模型组、肠安Ⅱ号高剂量组、中剂量组、低剂量组、痛泻要方组、白术内酯Ⅰ组、得舒特组、正常对照组。每日上午09:00，正常对照组及模型组分别给予生理盐水进行灌胃，治疗组分别给予白术内酯Ⅰ、痛泻要方和肠安Ⅱ号煎剂，按照大鼠体重0.8ml/100g进行灌胃给药，连续14d。
　　结果:
　　(1)对各组实验大鼠基本情况和肠粘膜组织形态观察可见:①造模后大鼠活动度、皮毛光泽度明显降低，用药后皮毛洁白光亮，活动度增加。②对大鼠进食量的影响，用药前（造模后），模型组及各用药组进食量比正常组显著减少(P＜0.001，p＜0.01);用药后模型组进食量比正常组显著减少(p＜0.01)，各用药组进食量与正常组进食量相当(P＞0.05)。③对大鼠体重的影响，用药前（造模后），模型组及各用药组大鼠体重比正常组较轻(P＜0.01，p＜0.05);用药后模型组及各用药组体重比正常组轻(p＞0.05)，用药后模型组大鼠体重增长量比正常组少(P＜0.01)，各用药组大鼠体重增长量与正常组增长量相当(P＞0.05)。④对各组实验大鼠大便含水量的影响，用药前（造模后）模型组及各用药组大便含水量比正常组高，但尚未达到统计学差异(P＞0.05);用药后，肠安Ⅱ号中、低剂量、白术内酯Ⅰ、痛泻要方大便含水量比模型组明显降低(P＜0.01，p＜0.05)。⑤结肠组织HE染色观察情况，正常组、用药组及模型组均未发现3分及3分以上病变，模型组在不同视野中有2分病变，肠安Ⅱ低剂量、痛泻要方、白术内酯Ⅰ、得舒特组视野观察中，有评分表现为轻度炎症1分，通过对HE评分进行统计分析可以看出，模型组评分比正常组显著升高(P＜0.001)，肠安Ⅱ中剂量、低剂量组与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，其余各用药组HE评分比模型组降低，但未达到统计学差异(P＞0.05)，各用药组治疗后HE评分仍比正常组高(P＜0.01)。⑥活化肥大细胞(MC)计数，肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无明显差异(P＞0.05)，模型组及其余各用药组MC计数比正常组显著增多(P＜0.001，P＜0.01)。⑦嗜铬细胞(EC)计数，肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无明显差异(P＞0.05)，模型组及其余各用药组比正常组显著增多(P＜0.001)。
　　(2)对PI-IBS大鼠疾病特征和证候特征的疗效情况:①对模型大鼠内脏敏感性的影响，用药前模型组及各用药组AWR注水量比正常组显著降低(P＜0.001)，用药后模型组AWR注水量比正常组显著降低(P＜0.001)，模型组用药后比用药前降低(P＜0.05)，各用药组在治疗后AWR注水量比治疗前明显提高(P＜0.001，P＜0.01)。②对血清中髓过氧化物酶(MPO)活力水平的影响，用药前（模成功后）模型组血清中MPO活力较高，与用药后模型组MPO活力水平无差异(p＞0.05)，用药后模型组血清中MPO活力水平比各用药组和正常组高，但没有达到统计学意义(p＞0.05)。③糖水偏好实验，模型组糖水偏好值比正常组显著降低(P＜0.001)，肠安Ⅱ号中、高剂量组、白术内酯Ⅰ、得舒特组糖水偏好值明显升高与正常组无差异(p＞0.05)。④旷场试验观察对大鼠活动度的影响，穿格数用药前（造模完成后）模型组与各用药组比正常组显著减少(P＜0.01，P＜0.05)，用药后模型组穿格数比正常显著减少(P＜0.01)，站立数用药前各组站立数比正常组显著减少，用药后肠安Ⅱ号中剂量组与正常组无差异(P＞0.05)，其余各用药组站立数增加，但与正常组比较仍存在显著差异(P＜0.001-0.05)，修饰数用药前肠安Ⅱ号中剂量组、痛泻要方组、得舒特组修饰数比正常组显著减少(P＜0.05)，其余各组修饰数比正常组减少，但未达到统计学意义(P＞0.05)，用药后肠安Ⅱ号中剂量、高剂量组修饰数增多。⑤对大鼠D-木糖代谢的影响，用药前各组大鼠的尿D-木糖含量比正常组显著降低(P＜0.001)，模型组大鼠在用药前、用药后无变化，用药后各用药组大鼠尿D-木糖含量与正常组相比无明显差异(P＞0.05)。
　　(3)对PI-IBS大鼠肠粘膜屏障的作用机制:①从机械屏障角度，在1.2万倍透射电镜下观察各组大鼠结肠上皮粘膜观察紧密连接状态，可见模型组结肠上皮细胞膜局部缺如，胞质肿胀，线粒体肿胀空泡化，紧密连接打开;肠安Ⅱ号高剂量、中剂量组结肠上皮细胞紧密连接完整，连接紧密;肠安Ⅱ号低剂量组结肠上皮细胞有紧密连接，连接缝隙略增宽;痛泻要方组结肠上皮细胞有紧密连接，紧密连接缝隙正常;白术内酯Ⅰ组肠上皮紧密连接可见连接缝隙较宽;得舒特组肠上皮可见紧密连接复合体完整，连接缝隙较宽松;正常组结肠上皮细胞完整，细胞间细胞膜完整，紧密连接复合体（紧密连接、缝隙连接及桥粒）完整，连接紧密。②对粘膜通透性的影响，模型组血清中血浆内毒素(LPS)水平比正常组显著升高(P＜0.001);用药后各用药组LPS水平比模型组显著降低(P＜0.05，P＜0.01)比正常组略高(P＜0.05，P＜0.01)。③对肠粘膜免疫屏障的影响，用药前模型组与各用药组CD4计数比正常组低(P＜0.001);各用药组CD4计数组间比较，肠安Ⅱ号高剂量=中剂量＞低剂量=痛泻要方=白术内酯Ⅰ=得舒特，各用药组和正常组CD8计数比模型组显著降低(P＜0.001);肠安Ⅱ号高、中、低剂量与正常组无差异(P＞0.05)，各用药组及正常组CD4/CD8比值均比模型组显著升高(P＜0.001);痛泻要方组CD4/CD8比值与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，肠安Ⅱ号各剂量组、白术内酯Ⅰ及得舒特比正常组略低，并有统计学差异(P＜0.05)。正常组及各用药组IL-4水平比模型组显著升高(P＜0.001)，用药干预后可使IL-4水平升高，肠安Ⅱ号高、中、低剂量比其他用药组水平高，但未达到统计学差异(P＞0.05)，正常组及各用药组IL-1β水平比模型组显著降低(P＜0.001，P＜0.05)，用药干预后可使IL-1β水平降低，各用药组中IL-1β水平肠安Ⅱ号高、中、低剂量比其他用药组低，但未达到统计学差异(P＞0.05)。用药组及正常组中活化的SIgA浆细胞数目比模型组显著增多(P＜0.001)达2倍余;各用药组中活化的SIgA浆细胞计数比正常组略低(P＜0.001);各用药组组间比较可见，肠安Ⅱ号中、低剂量、痛泻要方、白术内酯Ⅰ组中活化的SIgA浆细胞计数比肠安Ⅱ号高剂量组、得舒特组略高(P＜0.01)。肠安Ⅱ号中剂量、高剂量组肠管内壁粘液中SIgA水平比模型组显著升高(P＜0.05)，其他各用药组SIgA水平比模型组升高，但未达到统计学差异(P＞0.05)。正常组、肠安Ⅱ号高、中、低剂量组PGE2水平比模型组显著升高(P＜0.001，P＜0.05)，各组PGE2水平组间比较，肠安Ⅱ号中剂量＞正常组＞肠安Ⅱ号高剂量=肠安Ⅱ号低剂量=痛泻要方＞白术内酯Ⅰ=得舒特组(P＜0.05)。
　　研究结论：肠安Ⅱ号方具有药效学作用，具体为其高、中、低剂量组有调节胃肠动力和对迟发型变态反应显著抑制的作用，中、高剂量有抗炎和镇痛作用，并能延长镇痛的时间，高、中、低剂量有明显增强正常小鼠碳粒廓清指数的趋势。
　　通过新生母子分离+三硝基苯磺酸结肠灌注+慢性束缚刺激后，可以建立符合PI-IBS疾病特点和脾虚肝郁型证候特点的动物模型，主要体现在造成模型大鼠的内脏高敏感、抑郁状态、大便含水量增加、无炎症或轻度炎症的结肠组织病理形态等疾病特点，并有进食量减少、D-木糖代谢降低、活动度减少、抑郁等肝郁脾虚型的证候特点。给予肠安Ⅱ号方干预治疗后，出现疾病、证候特征的明显改善，并且对模型大鼠结肠粘膜上皮屏障具有良好的作用，可使得肠上皮细胞间紧密连接嵌合紧密，降低结肠粘膜的通透性，阻止外界大分子（细菌、病毒等）的入侵，并且通过提高保护因子，降低炎症损坏因子水平，激活免疫SIgA浆细胞，促其活化分泌SIgA到肠腔，从而激活细胞免疫到体液免疫的自我免疫保护机制，最终降低肠道炎症，降低内脏高敏感和大便含水量等，起到肠粘膜屏障的保护作用，从而达到治疗PI-IBS的目的。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分 文献综述

综述一 肠易激综合征(IBS)的研究进展

一、现代医学对IBS的研究进展

参考文献

二、祖国医学对IBS的研究进展

参考文献

三、近十年我国中医药治疗肠易激综合征临床疗效评价研究的文献分析

参考文献

综述二 肠易激综合征(IBS)动物模型的研究进展

1．IBS的疾病动物模型

2．IBS的病证结合动物模型

3．PI-IBS的动物模型

4．小结

参考文献

第二部分 实验研究

前言

实验一、肠安Ⅱ号方对小鼠的基本药效学研究

实验目的

材料与方法

结果

讨论

实验二、肠安Ⅱ号方对TNBS诱导炎症后肠易激综合征(PI-IBS)大鼠肠粘膜屏障的作用机制研究

实验目的

材料与方法

结果

讨论

参考文献

论文小结

1．研究主要结论

2．研究创新点

3．研究不足及展望

致谢

个人简介

附录