基于检测报告基因的雌激素受体调节剂研究模型的建立及应用

摘要

该研究根据经典的雌激素信号转导途径,建立了基于检测报告基因靶向ER亚型的ER调节剂研究模型.并以此模型比较研究了金雀异黄素和淫羊藿苷的雌激素活性.该研究还探讨了淫羊藿苷的抗辐射损伤作用.雌激素作用主要由ER介导.ER为核受体超家族成员,是配体依赖性核转录因子.ER分为ERα和ERβ两种亚型.雌激素与细胞内ERα和/或ERβ结合后,转运至核内,并与靶基因启动子区的特异性增强子序列——雌激素应答元件(ERE)结合,从而启动靶基因的表达.该研究根据ERE序列为puGGTCAnnnTGACCpy,设计合成了5个串联排列的ERE片段(5×ERE),并连接到启动子型报告基因载体pTAL-SEAP的多克隆位点,构建了重组报告基因载体pTAL-ERE-SEAP.将其分别与重组人ERα(hERα)表达载体pCXN2-hERα或hERβ表达载体pCXN2-hERβ瞬时共转染HEK293细胞.结果显示,E<,2>可通过ERα和ERβ诱导受ERE调控的报告基因SEAP的表达,转染后72hr SEAP活性最强.E<,2>和SEAP表达呈量效依赖关系,E<,2>的最大效应浓度为10<'-7>mol/L或10<'-8>mol/L,SEAP活性可增高20倍.ER拮抗剂ICI182,780可完全阻断E<,2>对报告基因的诱导作用.表明受ERE调控的报告基因载体pTAL-ERE-SEAP构建成功.该研究用hERα<'+>Hela和hERβ<'+>Hela细胞通过报告基因瞬时表达检测、ER<'+>细胞株——MCF-7细胞增殖实验以及在体动物实验比较研究了金雀异黄素(GEN)和淫羊藿苷(ICA)的雌激素活性.结果显示,GEN可刺激MCF-7细胞的增殖,可通过ERα或ERβ诱导受ERE调控的报告基因的表达,能增加性未成熟小鼠子宫系数.ICA对MCF-7细胞的增殖和ERE介导的报告基因的表达无影响,但可增加性未成熟小鼠子宫系数.表明GEN通过ERα或ERβ发挥雌激素样作用.ICA产生雌激素活性的机制尚不清楚,有待进一步研究.该研究还探讨了ICA的抗辐射损伤作用.结果显示,ICA可提高受电离辐射小鼠30天存活率,延长死亡动物平均存活时间.降低受照射小鼠胸腺、脾脏和骨髓细胞的Caspase-3活性,提高Bcl-2蛋白的表达量,抑制细胞的凋亡.表明ICA可能通过抑制细胞凋亡发挥抗辐射损伤作用.总之,该研究成功构建了受ERE调控的重组报告基因载体pTAL-ERE-SEAP.成功建立了稳定表达功能性hERα或hERβ和Hela细胞株——hERα<'+>Hela细胞株和hERβ<'+>Hela细胞株.用pTAL-ERE-SEAP载体和hERα<'+>Hela细胞株、hERβ<'+>Hela细胞株通过报告基因瞬时表达检测以及细胞增殖实验、在体动物实验研究发现,GEN和ICA可能通过不同的机制发挥雌激素样作用.该研究还表明,ICA可通过抑制细胞凋亡发挥抗辐射损伤作用.

目录

英文缩略词表

第一部分文献综述

综述一植物雌激素对靶细胞的调节作用

1.介绍

2.植物雌激素对类固醇信号转导的作用

3.植物雌激素的生物学作用

4.结论

参考文献

综述二雌激素受体调节剂及其相关中药

综述三植物雌激素拟雌激素活性和抗雌激素活性体外评价方法

综述四报告基因技术及其应用

1报告基因技术

2报告基因

3报告基因载体

4应用

5展望

参考文献

第二部分实验研究

实验一重组报告基因载体——pERE-TAL-SEAP的构建及表达

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4结论

参考文献

实验二稳定表达人雌激素受体亚型的Hela细胞株的建立

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4结论

参考文献

实验三淫羊藿苷与金雀异黄素雌激素活性的比较研究

实验四淫羊藿苷抗辐照损伤作用的研究

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

参考文献

致谢

个人简历

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