狂犬病病毒CTN不同克隆株的生物学和分子特性研究

摘要

世界卫生组织（WHO）和国际兽疫局（IOE/OIE）狂犬病咨询专家一致认为，通过接种疫苗消除动物狂犬病是预防控制人狂犬病发生的最经济有效的途径。目前针对动物的预防接种主要有注射免疫和口服免疫两种方式，然而 WHO认识到注射途径对犬的免疫存在局限性，鼓励研究犬的口服疫苗，发展安全有效的疫苗和诱饵。WHO的报告指出对犬进行口服免疫提供了一种提高犬免疫覆盖率的有意义的新措施，特别是对那些流浪犬和监管差的犬。口服免疫可以单独也可以与肌肉注射联合应用。目前我国还没有用于口服免疫计划的诱饵疫苗，本实验的目的就是从我国人用狂犬病疫苗生产用毒种 CTN-1株中筛选出适合运用于口服诱饵疫苗生产的减毒株，以弥补我国在流浪犬以及野生动物狂犬病预防免疫方面的空白。
　　狂犬病毒 CTN株系我国自行分离鉴定的毒株，传代背景清楚，且与我国目前分离的大多数狂犬病毒街毒株同源性较高，本研究第一部分采用CTN株高代次毒株挑斑纯化后的20个克隆株，编号为CTN-1-（1-20）。作为筛选基础，按照 WHO关于口服减毒活疫苗的相关指导原则，从毒力、免疫原性和遗传稳定性三方面筛选符合要求的减毒株。
　　毒力实验以对不同日龄小鼠的脑内致病力作为评价依据，首先采用3周龄小鼠初筛，每个病毒克隆株小鼠脑内注射从原液100到10-3的四个稀释度，每个稀释度6只，0.03ml/只，空斑同步滴定。结果显示20个空斑克隆株 LD50在0～3.16 log PFU之间，其中6株对小鼠脑内接种不致病。然后同法采用5日龄、10日龄、14日龄乳鼠进一步比较6株未致病毒株的相对毒力，以2.5-5.5 log PFU/只的感染剂量脑内接种。6个毒株对5日龄小鼠致死率均为100％，其中 CTN-1-3株对10日龄、14日龄小鼠未致病；CTN-1-16株对10日龄和14日龄的致死率分别为91.3%和40%；CTN-1-19株对14日龄以上小鼠不致病；这3株显示对小鼠脑内最低的致病力。
　　免疫效力实验和血清中和抗体实验分别参照 NIH法和RFFIT法。在多稀释度下分别对CTN-1-3株、CTN-1-16株和CTN-1-19株进行了两种免疫途径（肌肉、口腔）的比较实验并计算出相应的半数有效保护剂量（ED50）。以上3株肌肉免疫ED50依次为5.7、<3.8、<4.1 log PFU，口腔免疫 ED50依次为5.4、4.8、4.8 log PFU。肌肉免疫效果优于口腔免疫的原因可能是接种量小（0.1ml）,吸附进入口腔粘膜的量不足。在血清抗体效价实验中，以4.5 log PFU左右的剂量免疫，肌肉免疫组14天时 CTN-1-3/16/19株中和抗体平均效价分别是0.39 IU/ML，1.60 IU/ML,3.84 IU/ML,30天时抗体平均效价可达4.39 IU/ML,28.6 IU/ML,28.4 IU/ML；同理以4.5 log PFU左右的剂量免疫，口腔免疫组30天时 CTN-1-3株、CTN-1-16株中和抗体平均效价分别能达到2.91 IU/ML和8.70IU/ML，而 CTN-1-19株抗体结果为阴性，但当免疫剂量在6 log PFU时，CTN-1-19株抗体效价能达到7.57 IU/ML。以上结果表明3株弱毒克隆株具有良好的保护效果和抗体应答。此外3株弱毒株在乳鼠脑内连续传5代或颌下腺传1代，取鼠脑研磨液上清或颌下腺研磨液上清重新测定脑内致病力，结果小鼠未发病未见毒力返祖，表明具有良好的遗传稳定性。
　　为了掌握减毒株的分子生物学特征，并探明其安全性和免疫原性的分子基础，在本论文的第二部分对以上减毒株进行了全基因组序列的测定和对比分析，3株减毒株基因组全长均为11924个碱基，比亲本株 CTN-1相比少一个碱基。另外减毒株与亲本株共有18-20个核苷酸的差异，并引起了结构蛋白上7个氨基酸位点的改变。G蛋白上第 III抗原区发生两个关键氨基酸的突变，其中333位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺可能是3株克隆株减毒的重要原因。CTN系列株 B细胞抗原位点和T细胞抗原位点与其它常见减毒株和固定毒株相比存在不同程度的差异，其中 CTL抗原位点区发现有4-5个特异性的氨基酸残基。组织嗜性位点、糖基化、磷酸化等关键位点与其它毒株基本保持一致。
　　本研究经过致病性、有效性、遗传稳定性三方面的验证，已成功的筛选到了3株残余毒力低、免疫原性和遗传稳定性良好的减毒株，基本达到了WHO关于口服狂犬病疫苗候选毒株实验室条件下的相关要求。另外通过全基因组的测序分析基本掌握3株弱毒株的分子生物学特征，为下一步开展田间试验提供了充分坚实的科学依据。

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前 言

第一部分 狂犬病病毒 CTN 克隆株毒力、免疫原性和遗传稳定性研究

第一节 不同日龄小鼠脑内致病力研究

材料

方法

结果

第二节 不同免疫途径保护效力及血清中和抗体应答研究

材料

方法

结果

第三节 脑内及颌下腺传代遗传稳定性研究

材料

方法

结果

讨 论

小 结

第二部分 狂犬病病毒 CTN 弱毒克隆株的基因组结构特征研究

第一节 狂犬病病毒 CTN 克隆弱毒株全基因组序列测定与分析

材料

方法

结果

第二节 狂犬病病毒 CTN 克隆株与亲本株 CTN-1株的比对分析

结果

第三节 狂犬病病毒 CTN 系列株同其它毒株比对分析

结果

讨 论

小 结

参考文献

文献综述

英文缩略词表

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致谢

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