转基因细胞法测定重组药物生物学活性研究

摘要

生物学活性测定在重组药物的研究开发和质量控制中至关重要。目前的生物活性分析方法主要包括体内法（动物实验）和体外法（细胞与组织实验）。基于细胞的分析方法由于其具有操作简便，周期短，特异性好，变异度小等优点得到广泛应用。但许多重组药物由于药物作用的组织器官特异性，往往难以获得适用于活性测定的稳定的高反应性细胞株，而通过人工改造的转基因细胞可以解决这一难题。
　　本研究的目的是构建活性测定转基因细胞技术平台并应用于重组药物的生物学活性测定方法研究，以解决特定重组药物的测活难题。本研究内容共分为三部分，分别根据特定药物的具体作用机制采用了不同的策略构建活性测定用转基因细胞株。第一部分，导入天然受体的转基因细胞活性测定方法的建立和应用。脑利钠肽与其天然受体鸟苷酸环化酶A（GCA）结合后，可激活其胞內区的鸟苷酸环化酶活性，催化GTP转化为cGMP。构建GCA超表达的293GCAC3单克隆细胞株，通过检测cGMP含量的来测定重组人脑利钠肽的生物学活性。结果表明，该方法较传统的兔主动脉条法操作简便，周期短，变异小，可以作为一种有效的替代方法用于重组人脑利钠肽的生物活性分析。第二部分，同时导入天然受体和报告基因的转基因细胞活性测定方法的建立与应用。Byetalog与 GLP-1受体结合后，可提高细胞内cAMP水平，最终激活cAMP反应元件（CRE），增强下游基因的表达。构建GLP-1受体和CRE报告基因共转染的CHOglp1r/crec14单克隆细胞株，通过检测报告基因的表达来测定Byetalog的生物学活性。结果表明，该方法操作简便快速，变异度小，适用于Byetalog的生物学活性测定。第三部分，同时导入融合受体和报告基因的转基因细胞活性测定方法研究。构建VEGFR胞外区和IFNAR1/2胞内区的融合受体，与IFN反应元件（ISRE）报告基因共转染HEK293细胞，VEGF与胞外区的VEGFR结合后激活胞内的IFN信号通路，引起ISRE报告基因高表达，可以通过检测VEGF单抗对报告基因表达的抑制作用来测定其活性。成功构建了融合受体和ISRE报告基因，并经过瞬时转染及检测，rhVEGF121刺激后可以引起ISRE报告基因表达的增强，且具有剂量依赖效应。通过本课题的研究，我们初步形成了构建转基因细胞活性测定方法的研究策略和技术路线，并成功构建了两个转基因细胞株，建立了相应的检测方法。本课题研究成果为建立活性测定转基因细胞技术平台打下了良好基础。

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英文摘要

前 言

1 重组人脑利钠肽（rhBNP）活性测定方法研究

1.1 实验试剂与仪器

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

1.5 小结

2 RGA法测定Byetalog生物学活性

2.1 主要仪器

2.2 试剂与材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

2.6 小结

3 VEGF单抗活性测定方法研究

3.1 试剂与材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

总 结

参考文献

综 述

致谢

附录1

附录2

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