胰岛素调控大鼠肝癌细胞系报告基因表达的基础

摘要

为了研究磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)启动子片段在肝细胞内的转录调节作用,该课题主要进行了以下工作:首先,构建及鉴定荧光素酶报告质粒pGL2-PEPECK-Luc.随后,通过脂质体(Lipofectin)转染法将构建的报告质粒与内对照质粒pSV-β-Galactosidase共同转染大鼠肝肿瘤细胞系(CBRH7919),以不含任何启动子的pGL2-Basic-Luc质粒作为荧光素酶表达活性对照,设定背景荧光强度为1.最后,研究PEPCK启动子序列在肝细胞内对报告基因转录的调节作用.总之,该研究成功的构建了含有PEPCK启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL2-PEPCK-Luc,并将其转染至大鼠的肝肿瘤细胞系中,借助荧光报告系统,观察多种因素对基因转录的调节.

目录

英文缩写词表

前 言

实验材料

一、工具酶

二、细胞培养及转染试剂

三、主要生化试剂

四、菌株

五、细胞株

六、质粒

七、主要仪器设备

实验方法

一、荧光素酶报告质粒pGL2-PEPCK-luc的构建及鉴定

1.质粒DNA的碱法小量制备

2.质粒DNA的大量制备

3.质粒的纯化

4.DNA限制性内切酶酶切及其他酶的处理

5.从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

6.DNA片段的连接

7.感受态大肠杆菌的制备

8.质粒的转化和鉴定

9.质粒DNA的双链测序

二、荧光素酶报告基因在肝细胞系中的瞬时表达及酶活性的测定

1.细胞培养

2.LipofectinTM法转染细胞

3.转染细胞荧光素酶表达活性的测定

三，荧光素酶报告质粒的体外表达实验

结 果

一、克隆质粒的酶切图谱分析及核苷酸序列测定

1.中间载体质粒的构建和鉴定

2.荧光素酶报告质粒pGL2-PEPCk-Luc的构建及鉴定

二、荧光报告质粒在肝细胞内基因转录调控的研究

1.脂质体法转染大鼠肝癌细胞系及瞬时表达荧光素酶活性的测定

2.PEPCK启动子序列在肝细胞内对基因转录的调节

讨 论

参考文献

致 谢

综述1

参考文献

综述2

参考文献

简 历