四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

摘要

目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础.方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR.将具有串联2个四环素调控子结合位点(Tet02)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-Tet02载体,应用ABI 3130测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2PCR产物进行测序分析.再将p-gaI克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal.利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达.将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达.pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素(4 mg·L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达.结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游.pcDNA3.1-Tet02-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体.RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达.给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR基因的HepG2细胞内表达受到抑制.结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达.