胰腺癌血浆蛋白质组学研究及候选肿瘤标志蛋白的验证与评价

摘要

研究背景近年来，胰腺癌在我国的发病率和死亡率呈上升趋势。目前胰腺癌的5年生存率只有4％左右，在所有癌症中最低。其主要原因为诊断晚、手术切除率低。因此提高胰腺癌的早期诊断水平是改善预后的关键。此外，在临床实际工作中，慢性胰腺炎与胰腺癌的鉴别有时非常困难，但两者的处理方法和预后却迥然不同。 血清CA19-9是目前应用最广泛的胰腺癌肿瘤标志物，但人群中约有10％～15％的Lewis阴性者不分泌CA19-9，此外CA19-9对于早期胰腺癌的诊断价值有限。因此寻找新的有助于胰腺癌早期诊断和鉴别诊断的标志物具有重要意义。 蛋白质组学是20世纪90年代新出现的一门学科，目前已经广泛应用于肿瘤等疾病的研究，发现了一批新的候选蛋白标志物。同样，蛋白质组学也为胰腺癌的研究带来了新的思路和方法。LuZH等利用二维凝胶电泳(2-DE)的方法对胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织进行比较蛋白质组学研究，共发现和鉴定了110种在癌组织中差异表达的蛋白。此外也有研究利用近几年新出现的表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)的方法在胰液和血清中寻找胰腺癌的标志物。但利用2-DE这种经典的蛋白质组学方法进行胰腺癌血浆的蛋白质组学研究尚未见报道。 研究目的1.利用2-DE方法比较胰腺癌(术前、术后)、正常人和慢性胰腺炎患者血浆中的差异蛋白，寻找和鉴定与胰腺癌相关或特异的生物标志分子。 2.对LuZH等在胰腺癌组织蛋白质组学研究中所发现的2种候选标志蛋白(Galectin-3和AnnexinⅠ)进行验证，并评价其对胰腺癌的诊断价值。 研究对象和方法1.胰腺癌血浆的比较蛋白质组学研究·选择12例胰腺癌患者以及与之性别年龄匹配的12例正常人和10例慢性胰腺炎患者的血浆标本进行研究。 ·对去除白蛋白(ALB)和IgG以及超滤去除大分子等预分离方法进行摸索和评价，确定最佳的血浆2-DE方案。 ·通过比较胰腺癌(术前、术后)、正常人和慢性胰腺炎患者的血浆2-DE图谱，寻找差异蛋白并进行质谱鉴定。 2.候选肿瘤标志蛋白的验证与评价·分别对59例和33例胰腺癌患者的组织标本进行Galectin-3和AnnexinⅠ的免疫组化研究。比较这两种蛋白在癌组织和癌旁正常胰腺组织中的表达情况。 ·利用ELISA试剂盒检测血清和胰液的Galectin-3水平，比较胰腺癌与对照之间的差异，评价血清和胰液Galectin-3对胰腺癌的诊断价值。血清标本包括42例胰腺癌，77例正常和其他消化系统疾病对照。胰液标本包括24例胰腺癌，16例胰胆良性疾病。 ·利用能够检测抗原抗体反应的光学蛋白芯片(Opticalproteinchip，OPC)系统对血清和胰液进行AnnexinⅠ的初步检测和分析。血清标本包括13例胰腺癌，19例正常及消化系统良性疾病对照。胰液标本包括4例胰腺癌和4例胰胆良性疾病。 结果1.胰腺癌血浆蛋白质组学研究·去除ALB和IgG的预处理使血浆2-DE图谱的局部分辨率提高，同时由于上样量的增加，有利于一些含量较低蛋白的质谱鉴定。但这种预处理方法并不能明显增加蛋白点数。 ·超滤的方法可以有效地去除包括部分高丰度蛋白在内的大分子蛋白，有利于小分子蛋白的显示和质谱鉴定。但此方法仍然难以显示低丰度蛋白。 ·通过血浆2-DE图谱的比较，共发现并鉴定了5种与胰腺癌或慢性胰腺炎相关的差异蛋白：Haptoglobin(Hp)、Hemoglobin(Hb)、α1-antitrypsin(α1AT)、ImmunoglobinJchain(IgJ)和Leucine-richα2-glycoprotein(LRG)。 ·Hpβ链在胰腺癌患者中轻度升高，胰腺癌患者的Hp2-2表型的比例高于正常人，而缺少Hp1-1表型。胰腺癌和慢性胰腺炎患者的血浆Hb高于正常人，升高范围＞2倍。在20～kDa的区域内发现了与α1AT序列相同的蛋白，可能为α1-AT的片断，此蛋白与正常区域内的α1AT变化大致相同，即慢性胰腺炎＞胰腺癌＞正常人。慢性胰腺炎患者的IgJ链高于胰腺癌患者和正常人，可能来源于血浆中的分泌型IgA(sIgA)。胰腺癌患者的LRG水平较正常人和慢性胰腺炎轻度升高。术后Hp、正常区域内的α1AT和LRG均明显升高，未发现术后明显下降的蛋白。 2.候选肿瘤标志蛋白的验证与评价·胰腺癌组织Galectin-3的表达水平高于癌旁正常胰腺导管，表达情况与分期、分化等临床病理指标之间没有显著相关。 ·胰腺癌组织AnnexinⅠ的表达水平与癌旁正常胰腺癌导管相比没有显著性差异，但癌旁正常胰腺腺泡无AnnexinⅠ的表达，因此癌组织AnnexinⅠ的总量高于癌旁正常胰腺组织。胰腺癌中AnnexinⅠ的表达程度似乎与性别和年龄有关，但表达情况与分期、分化没有明显相关。 ·胰腺癌患者的血清Galectin-3高于正常人(中位数13.1ng/ml：9.85ng/ml，P＜0.005)。但与消化系统良性疾病和恶性疾病相比没有显著差异。以10.3ng/ml为cutoff值，诊断胰腺癌和正常人的敏感性和特异性分别为73.8％和55.3％。肿瘤切除后血清Galectin-3水平增加。血清Galectin-3水平与胰腺癌分期没有明显相关。 ·大部分胰腺癌患者和所有良性疾病患者的胰液中均能检测到Galectin-3，但两组之间没有显著性差异。以13.7ng/ml为cutoff值，其鉴别胰腺癌和胰腺良性疾病的特异性可达93.7％，但敏感性只有37.5％。 ·OPC系统检测结果显示，大部分血清标本的检测值高于抗体对照，胰腺癌和良性疾病的检测值有高于正常人的趋势。而所有胰液标本的检测值均与抗体对照相差不大。 结论1.去除ALB和IgG以及超滤去除大分子的预处理方法对于血浆蛋白的差异比较并无太大优势。但在质谱鉴定方面可以与未处理的方法互相补充。 2.2-DE方法能够同时发现多个血浆蛋白的量及表型的差异，但与SELDI-TOF方法一样，限于血浆蛋白丰度的巨大动态范围，难以发现中低丰度蛋白的差异。 3.在我们所发现的5种差异蛋白中，Hp的表型、Hb、IgJ链和LRG与胰腺癌/慢性胰腺炎的关系在以往的文献中并无报道，这些差异蛋白对于胰腺癌或慢性胰腺炎的意义及诊断价值还需要进一步的验证。 4.免疫组化的结果证实了胰腺癌组织蛋白质组学研究的结果，即癌组织Galectin-3和AnnexinⅠ的总量高于癌旁正常胰腺组织，但如果与癌旁正常胰腺导管相比，则癌组织中Galectin-3过表达，但AnnexinⅠ无过表达。因此提示对于组织的蛋白质组学研究结果还需要利用免疫组化等方法做进一步的验证和分析。 5.血Galectin-3对于诊断胰腺癌和正常人有一定价值。胰液Galectin-3对于鉴别胰腺癌和胰胆良性疾病有一定价值。胰腺癌患者血清中升高的Galectin-3可能并非来源于肿瘤。 6.血清中可能存在AnnexinⅠ蛋白，而且胰腺癌似乎高于正常人。胰液中没有AnnexinⅠ蛋白或含量极低。

目录

英文缩写

前 言

第一部分胰腺癌血浆的比较蛋白质组学研究

实验材料与方法

结果

一、2-DE分离血浆蛋白

二、差异蛋白的比较和鉴定

讨论

小结

参考文献

第二部分候选肿瘤标志蛋白(Galectin-3和Annexin I)在胰腺癌组织、胰液和血清中的表达及其对胰腺癌诊断价值的研究

材料与方法

结果

一、胰腺癌组织Galectin-3的免疫组化结果

二、胰腺癌组织AnnexinI的免疫组化结果

三、血清和胰液Galectin-3的检测结果及其对胰腺癌的诊断价值

四、血、胰液Galectin-3和胰腺癌组织Galectin-3表达之间的关系

五、OPC系统检测血清和胰液AnnexinⅠ结果

讨论

小结

参考文献

综 述 血浆蛋白质组学及其在肿瘤标志物研究中的应用与进展

个人简历及发表文章

致谢