糖原累积症-Ⅲ型的临床和糖原脱枝酶基因突变分析

摘要

糖原累积症-Ⅲ型的临床和糖原脱枝酶基因突变分析背景目的：糖原累积症是以糖原代谢障碍为特点的一组呈高度遗传异质性的遗传代谢病；病因是催化糖原合成和分解的某些酶先天性缺陷。临床上根据不同糖原累积症发现的时间顺序和酶蛋白缺陷的不同，用罗马数字把它分为10个亚型，即糖原累积症-Ⅰ型(Glycogenstoragedisease-typeⅠ，GSD-Ⅰ型)、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅵ型、Ⅸ型、0型、Fanconi-Bickel综合征、GSD-Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅶ型。 GSD-Ⅲ型(MIM232400)是由于糖原脱枝酶(amyloglucosidase，AGL)活性缺乏引起的一组临床症状。AGL活性缺乏使糖原在糖链分枝处分解葡萄糖时出现障碍，导致大量形态结构异常的短侧链糖原在肝脏伴或不伴在肌肉蓄积；出现肝肿大、低血糖和酸中毒等临床症状和病理生化改变；本病为常染色体隐性遗传病。 在儿童期最常见的是GSD-Ⅰ型和GSD-Ⅲ型，二者临床表型相似，但治疗和预后却不同；GSD-Ⅲ型胎儿的羊水绒毛细胞中AGL活性相对较低，用酶学测定存在技术上困难。如何从临床和分子生物学水平进行研究是临床诊断、治疗和产前诊断等面临的问题。 AGL定位于1p21，DNA全长85kb，包含35个外显子，AGL单体蛋白包含1532个氨基酸，分子量为170kDa。目前在非洲、亚洲及欧美等国家已经有GSD-Ⅲ型的报道，一般采用单链构象多态性分析(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP)，DNA序列分析，限制性酶学分析和家系分析等方法对AGL基因进行分子生物学研究，发现了多达51种不同的突变，但至今仍未发现突变热点。鉴于中国对糖原累积症的研究起步较晚，国内尚未见到GSD-Ⅲ型的相关研究。本论文拟对近二十年来在北京协和医院儿科遗传咨询门诊就诊，临床诊断为GSD-Ⅲ型的22例患儿的临床特点进行分析，并对其中的6个家系进行AGL基因突变分析(即DNA序列分析)和家系分析；以期了解中国GSD-Ⅲ型的临床表现和AGL基因突变情况，为在国内建立GSD-Ⅲ型的诊断体系打下初步基础。 方法：收集1980年至2004年间在北京协和医院儿科遗传咨询门诊就诊，并住院治疗，长期随诊的临床诊断为GSD-Ⅲ型的22例患儿(均符合以下入选标准)进行临床分析；在知情同意的基础上，对其中6例GSD-Ⅲ型患儿及其家系成员(共18人)进行AGL基因突变分析，即应用GSD-Ⅲ型患儿及其父母的外周血DNA，采用PCR的方法，对GSD-Ⅲ型患儿的AGL基因中参与编码蛋白的33个外显子和相邻的内含子进行扩增和直接测序，之后进行AGL基因突变分析。 GSD-Ⅲ型临床入选标准：具备(1)临床表现：自幼发现肝肿大；自幼出现复发性低血糖。(2)空腹肾上腺素刺激1小时后血糖上升＜35mg/dl；餐后2小时肾上腺素刺激1小时后血糖上升≥35mg/dl。(3)除外其他因素引起的肝肿大。 结果：1、临床部分：临床诊断为GSD-Ⅲ型的22例患儿分布于全国15个省市，男16例，女6例；平均出现症状年龄为1.2±0.9岁，平均就诊年龄为5.1±4.1岁。22例GSD-Ⅲ型患儿均有低血糖表现，即易饥饿症状(约40.9％)，低血糖抽搐(约27.3％)，无症状性低血糖(约22.7％)，鼻衄(约4.5％)，低血糖晕厥(约4.5％)；均有肝脏明显增大(触诊平均肋下10.0cm左右)，Bus超声未发现纤维化样改变；22例GSD-Ⅲ型患儿的空腹肾上腺素刺激试验1小时后血糖上升均＜35mg/dl(血糖值平均升高18.7±11.2mg/dl)；餐后2小时肾上腺素刺激试验1小时后血糖上升均≥35mg/dl(血糖值平均升高75.5±33.9mg/dl)；均除外了其他因素引起的肝脏肿大，符合GSD-Ⅲ型的临床入选标准。 另外，22例GSD-Ⅲ型出现脾脏增大(约90.0％，B超下脾厚大约3.4cm左右)；身材矮小(约72.7％)，骨龄落后(约37.5％)和体重偏低(约27.3％)；肌无力症状(约50％)和心脏肥大(约31.3％)。肾脏不增大(100％)。 22例GSD-Ⅲ型患儿的谷丙转氨酶均升高(100％，平均值为420.6±585.5u/l)；酸中毒(约68.2％，剩余碱平均值为-5.5±4.3mmol/l)；空腹血糖低于正常(约68.2％，血糖平均值为43.2±15.6mg/dl)，空腹血糖偏低值(约占31.8％，血糖平均值为58.5±10.25mg/dl)；高血脂(约59.1％，甘油三酯平均值为287.1±257.5mg/dl，胆固醇平均值为226.9±118.3mg/dl)；肌酸激酶等心肌酶升高(约70.6％，肌酸激酶平均值为730.5±870.7u/l，乳酸脱氢酶平均值为414.1±151.9u/l，谷草转氨酶平均值为534.1±512.8u/l，α-羟丁酸脱氢酶平均值为363.8±105.1u/l)；4例(20例)GSD-Ⅲ型患儿的尿酸轻度升高(约20％)。 10例(19例)血乳酸轻微升高(约52.6％)。22例GSD-Ⅲ型患儿中6例患儿的组织病理提示肝脏内有大量糖原累积(100％)。 2、基因部分：在患儿2的AGL基因检测中发现外显子8同义突变(894C→T，L298L，父源)和外显子34无义突变(4348G→T,E1450X，母源)。在患儿3中发现外显子3上游非翻译区-10G→A碱基替换(母源)和外显子8同义突变(894C→T，L298L,父源)。在患儿4中发现外显子35下游+65位非翻译区4664insCT。在患儿5中发现外显子10错义突变(1160G→A，R387Q，母源)和外显子16移码突变(1944_1951delGCCATAGA，648X，父源)。在患儿6中发现外显子12无义突变(1287T→G，Y429X，母源)和外显子26错义突变(3343G→A，G¨15R，父源)。在患儿1的外显子和相邻内含子区中未发现突变。 结论：1、GSD-Ⅲ型临床特征：1)GSD-Ⅲ型的AGL基因突变导致AGL酶的质和/或量发生改变，引起临床一系列表现，即全部GSD-Ⅲ型患儿表现低血糖症状、肝肿大和肾脏不大，绝大多数伴脾肿大，部分患儿表现为身材矮小和肌无力等症状，全部患儿谷丙转氨酶升高，部分患儿有低血糖、酸中毒、高血脂和肌酸激酶升高等生化指标改变，部分患儿出现骨龄落后、心脏肥大和体重偏低；GSD-Ⅲ型患者需密切随访肝脏功能及其病理改变。 2)GSD-Ⅲ型患儿空腹肾上腺素刺激实验血糖不能正常升高，餐后肾上腺素刺激实验血糖正常升高。 2、AGL基因突变分析部分：1)在6例GSD-Ⅲ型患儿的AGL基因中发现三种新突变，即外显子12的1287T→G(Y429X)、外显子16的1944_1951delGCCATAGA(648X)和外显子34的4348G→T(E1450X)，支持临床GSD-Ⅲ型的诊断；检测出五种多态性改变，即外显子3的-10G→A、外显子8的894C→T(L298L)、外显子10的1160G→A(R387Q)、外显子26的3343G→A(G1115R)和外显子35的+65位4664insCT。其中G1115R、E1450X和4664insCT位于AGL糖原结合区；R387Q、Y429X和648X位于AGL酶的活性区域。 2)本研究发现的三种新突变各不相同，国外发现的51种突变也没有发现突变热点，故目前应用AGL基因组DNA筛查的方法进行基因诊断和产前诊断临床可行性较小，可以采用cDNA等方法继续研究。 3)因为在GSD-Ⅲ型患儿的AGL中至今未发现突变热点，所以目前AGL的基因诊断方法尚不能代替AGL酶学诊断，也不便用于GSD-Ⅲ型和GSD-Ⅰ型鉴别诊断。

目录

中英文对照缩略表

前言

材料与方法

结果

一、根据本次研究的临床诊断标准，总共收集了22例GSD-III型的患儿的临床资料分析如下：

二、入选的GSD-III型患儿AGL基因突奕分析结果

三、6例GSD-III型患儿的临床资料和AGL基因突变分析

讨论

小结

参考文献

综述 糖原累积症的临床和遗传学研究新进展

一、肝糖原累积症

一)糖原累积症-Ⅰ型

二)糖原累积症-Ⅱ型

糖原累积症-Ⅲ型

糖原累积症-Ⅳ型

糖原累积症-Ⅴ型

糖原累积症-Ⅵ型

糖原累积症-Ⅶ型

糖原累积症-Ⅸ型

其它糖原累积症

参考文献

附录

致谢