联合应用DNA免疫和细胞加强制备CD55单克隆抗体及抗体生物学活性分析

摘要

实验目的：用DNA免疫和细胞加强方法制备抗人CD55分子单克隆抗体(Mab)，并对其生物学特性进行初步研究，确定该方法制备抗体的可行性。 实验方法：RT-PCR方法克隆CD55分子编码区全长基因，将扩增基因定向导入真核表达载体pcDNA3.1和原核表达载体pET28a中。诱导pET28a/55载体在大肠杆菌Rosseta中表达CD55，表达产物以包涵体形式存在。通过盐酸胍变性溶解包涵体，并经镍柱纯化得到重组CD55蛋白。重组质粒pcDNA3.1/55采用多次肌肉注射方法免疫小鼠，并在每次DNA免疫前对小鼠股四头肌做预处理①DNA免疫前1周注射蛇毒心肌毒素；②DNA免疫前15分钟注射25％的高渗蔗糖溶液。与细胞融合前3天，用高表达CD55分子HPB-ALL细胞加强免疫一次，之后采用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备抗CD55分子单克隆抗体。通过流式细胞术检测每次免疫后小鼠血清中抗体分泌情况。应用夹心ELISA方法检测抗体的类型，并利用抗体竞争实验初步验证制备抗体的表位。通过流式细胞仪(FACS)、荧光显微镜验证抗体与天然细胞膜蛋白的结合活性和特异性；Westernblot印证抗体与变性线性蛋白结合活性。 实验结果： (1)扩增CD55全长基因1174bp，构建成pcDNA3.1/55重组质粒。 (2)采用FACS检测血清滴度，3次DNA免疫后其最高为1∶200，细胞加强后滴度最高为1∶800。 (3)通过细胞融合、筛选和克隆化培养最后得到两株单克隆抗体分别为2B6E和2B6B。 (4)两株抗体IgG亚类均为IgG2a，轻链均为为κ型。 (5)抗体免疫竞争实验表明2B6B、2B6E、IA10(BD)和67(Serotec)之间识别不同的抗原表位。 (6)FACS、免疫荧光显微镜和Westernblot实验表明抗体与天然细胞膜蛋白和变性膜蛋白及重组蛋白都有良好的结合活性和特异性。 实验结论：pcDNA3.1/55肌肉内免疫后能激发小鼠产生针对CD55分子的抗体，联合应用细胞加强免疫可显著提高抗体的滴度，而不影响其特异性。而且此方法制备的单克隆抗体具有良好的结合活性和特异性，这为以后探讨制备单克隆抗体的方法提供新思路，也为日后改造CD55单克隆抗体，进行靶向治疗的研究打下基础。

目录

摘要

前 言

材料与试剂

第一部分 CD55基因的克隆和重组真核表达质粒pcDNA3.1/55的构建

第二部分 CD55分子SCR-S/T区表达

第三部分 单克隆抗体的制备及活性分析

讨论

结 论

参考文献

综述DAF（CD55）的生物学功能及与肿瘤的关系

附录一：溶液配制

附录二：英文缩略词表

致谢

在读期间发表论文情况