甲真菌病诊断方法的改良及致病菌毒力相关因子的初步研究

摘要

甲真菌病是皮肤科的常见病和多发病，真菌学检查是确诊的主要依据，但现有方法尚难以满足临床的需要；此外，对该病致病菌毒力因子的研究仍处于起步阶段，且多数未与临床表现相结合。本课题就甲真菌病诊断方法的改良及其致病菌的毒力相关因子展开研究，包括以下四部分内容：第一部分甲真菌病临床诊断指征的初步探讨目的对甲真菌病的临床特征进行深入研究，以期发现该病及其致病菌临床诊断的指征，作为实验室检查和流行病学调查的辅助方法。方法收集甲真菌病及非甲真菌病病例，详细记录患者的一般情况、病史及病甲特征，对数据进行统计学处理。结果1.共收集124例甲真菌病和29例其它甲病病例，培养阳性者中75例为红色毛癣菌，6例念珠菌，1例尖孢镰刀菌，1例厚皮马拉色菌，1例白念珠菌+红色毛癣菌。2.有6项病史(手足多汗史，浅部真菌病病史，密切接触者中有浅部真菌病患者，掌跖脱屑史，趾指间浸渍糜烂史，掌跖/趾指腹水疱史)和2项体征(掌跖脱屑，单侧指甲受累)高度提示甲真菌病；3.与红色毛癣菌相比，指甲尤其是右侧指甲受累及甲分离高度提示念珠菌感染。结论甲真菌病有某些特征可作为诊断线索，临床指征的最终确立尚有待多中心、大样本、涵盖不同人群、包括不同致病菌的流行病学调查。 第二部分甲真菌病诊断培养基的改良研究第一章改良皮肤癣菌试验培养基的实验研究目的对DTM培养基作适当改进，筛选出最佳配方，有利于甲真菌病等浅部真菌病的快速诊断和治疗方案的制定。方法1.采用正交设计法和单因素分组试验对培养基的主要影响因子进行量和质的优化组合，筛选出改良培养基。2.将红色毛癣菌标准菌株菌悬液倍比稀释，接种于DTM和改良培养基上，测定检出灵敏度。3.将3属18种皮肤癣菌和11属14种非皮肤癣菌的丝状真菌接种于DTM和改良培养基上，比较特异性。结果1.培养基的氮源，碳源，pH值和指示剂的调整对变色时间的影响无显著性差异(P＞0.05)，从经济和早期判断颜色是否改变的难易程度考虑，确定改良培养基主要配方：0.5％大豆蛋白胨，0.5％葡萄糖，指示剂为溴百里酚蓝(bromothymolblue，BTB)；2.DTM和改良培养基的检出灵敏度均为103cfu/mL(2×10cfu/培养基)；3.所有受试的皮肤癣菌均能使两种培养基变色，相对变色时间tr(开始变色时间—开始生长时间)DTM为-2d～0d，改良培养基为-4d～0d；绝大多数受试的非皮肤癣菌的丝状菌也能使两种培养基变色，trDTM为1d～5d，改良培养基为1d～6d。结论改良培养基的配方比DTM经济，较DTM更易观察到早期颜色的改变。 第二章改良皮肤癣菌试验培养基(DTM)的临床研究目的将改良DTM培养基应用于甲真菌病临床标本的检测，并与原DTM培养基比较，以评价其临床实用性。方法收集临床拟诊或欲排除甲病的标本，分别接种于改良DTM、DTM、SCCA和SCA培养基；记录菌株的开始生长时间、开始变色时间及开始变色时菌落的直径。以专业真菌实验室的鉴定结果为金标准，将DTM和改良DTM报告的结果与之比较。结果1.改良DTM、DTM、SCCA的分离率、菌株的生长速度及形态无显著差异；2.所有分离的皮肤癣菌均能使两种显色培养基变色，改良DTM的开始变色时间(5.83±0.39d)早于DTM(7.32±0.41d)；3.大多数分离的非皮肤癣菌也能使两种培养基变色，以开始变色时菌落的直径大小为皮肤癣菌和非皮肤癣菌的鉴别点与金标准有高度的一致性。结论DTM和改良DTM比传统的鉴定方法结果报告时间提前1周左右，改良培养基的配方较DTM经济，肉眼观察其开始变色时间早于DTM，值得进一步地深入研究。 第三部分PCR快速诊断甲真菌病的研究第一章PCR快速诊断浅部真菌病目的初步评价应用PCR技术直接从临床标本中检测浅部真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法处理临床标本，从中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物ITS1进行PCR扩增检测，并与直接镜检和培养法作对比。结果共收集112例临床标本，PCR检测、直接镜检和培养的敏感度分别为80.7％、96.5％和70.2％，特异度分别为100％、89.1％和100％，阳性预测值分别为100％、90.2％和100％，阴性预测值分别为83.3％、96.1％和76.4％。PCR方法在24h内即可完成从标本处理至结果判读的全过程。结论PCR检测具有较好的特异性和准确性，且比培养法缩短了近2w的时间，为临床快速诊断和及时、合理地治疗浅部真菌病提供参考。 第二章多重PCR诊断甲真菌病的实验研究目的初步建立多重PCR诊断甲真菌病的方法。方法选择3对引物(真菌通用引物，皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重PCR体系，采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性；并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果1.筛选得到的真菌通用引物NS、皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性；2.在适宜的反应条件下，无论对单模板，还是多模板，该反应体系均能扩增出目的片段，未见明显非特异片段的干扰；3.该反应体系的检测灵敏度为102cfu/mL。结论多重PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌，酵母和非皮肤癣菌的丝状菌等三类病原菌，结果直观易读，其实用性尚有待于在临床标本的检测中验证。 第三章多重PCR快速诊断甲真菌病的临床研究目的初步评价应用多重PCR技术直接从临床标本中检测甲真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法处理临床标本，从中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物NS，皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1同时进行PCR扩增检测，并与直接镜检和培养法作对比。结果共收集104例临床标本，PCR检测、直接镜检和培养的敏感度分别为93.3％、100％和64.4％，特异度分别为100％、86.4％和100％，阳性预测值分别为100％、84.9％和100％，阴性预测值分别为95.2％、100％和78.74％。PCR方法在24h内即可完成从标本处理至结果判读的全过程。结论多重PCR检测具有较好的特异性和准确性，可初步将甲真菌病的三大类病原菌区分开，且比培养缩短了近2w的时间，可为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病提供参考。 第四章多重RT-PCR诊断甲真菌病的实验研究目的初步建立多重RT-PCR诊断甲真菌病的方法。方法采用Trizol提取真菌的RNA；选择3对引物(真菌通用引物，皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重RT-PCR体系，采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性；并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果1.所采用的真菌通用引物28SrDNA、皮肤癣菌特异性引物ACT和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性；2.在适宜的反应条件下，无论对单模板，还是多模板，该反应体系均能扩增出目的片段，未见明显非特异片段的干扰；3.该反应体系对模拟临床标本的检测灵敏度为102cfu/ml。结论多重RT-PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌，酵母和非皮肤癣菌的丝状菌等三类病原菌，并可衡量菌的活力，有利于判断甲组织是否存在真菌的感染。 第四部分甲真菌病致病菌毒力相关因子的体外研究第一章甲真菌病分离菌株体外角蛋白酶活性的测定目的对甲真菌病常见致病菌及污染菌进行体外降解角蛋白能力的比较，以初步探讨该病的临床表现与角蛋白酶的相关性，为该病发病机制及治疗新途径的研究提供参考。方法角蛋白酶的诱导培养基为含甲或大豆蛋白胨的培养基，测定的底物为keratin-azure，以A595nm值衡量角蛋白酶的活性。结果1.来自两种诱导培养基的菌株的角蛋白酶活性无显著性差异；2.皮肤癣菌与非皮肤癣菌的角蛋白酶活性无显著性差异；3.红色毛癣菌角蛋白酶活性显著高于其他受试真菌；4.不同SCIO积分段的甲真菌病红色毛癣菌临床分离株角蛋白酶活性的差异无统计学意义。结论甲真菌病的发病与角蛋白酶有一定相关性，但仅用角蛋白酶尚不能完全解释该病的发病机制。 第二章甲真菌病分离菌株细胞外水解酶活性的测定目的对甲真菌病常见致病菌及污染菌进行细胞外水解酶活性的测定，以期发现可能与该病相关的毒力因子。方法诱导培养基为含甲或大豆蛋白胨的培养基，细胞外水解酶谱的测定体系采用APIZYM。结果1.与1％大豆蛋白胨培养基相比，受试的参照菌株在含甲培养基中有3种酶(Phosphataseacid，Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase，β-glucuronidase)的活性增加有统计学意义；2.与非皮肤癣菌相比，来自于含甲培养基的皮肤癣菌有4种酶活性的增加有统计学意义：Esterase(C4)，EsteraseLipase(C8)，N-acetyl-β-glucosaminidase，a-mannosidase；3.与非红色毛癣菌相比，来自于含甲培养基的红色毛癣菌有1种酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)活性的升高有统计学意义；4.不同SCIO积分段的甲真菌病红色毛癣菌临床分离株除Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase外，其余酶的活性差异无统计学意义。结论水解酶的活性与菌株的种类和培养基的成分有关，并对甲真菌病的的临床表现可能有一定影响，但究竟何种酶对发病机制更有意义尚需作进一步的研究，

目录

前言

全文摘要

第一部分甲真菌病临床诊断指征的初步探讨

第二部分甲菌病诊断培养基的改良研究

第三部分PCR快速诊断甲真菌病的研究

第四部分甲真菌病致病菌毒力相关因子的体外研究

全文小结

综述

致谢