氧化损伤体内外衰老模型的建立与应用及格尔德霉素在Beagle犬药代动力学的研究

摘要

衰老机制的研究是生命科学的研究热点。衰老机制的研究离不开衰老模式系统的建立和应用。衰老模式系统一般包括酵母、线虫、果蝇、鼠等模式生物和细胞模型。细胞模型是目前国际上公认的重要研究模型之一。细胞是生物体的基本单位，细胞衰老与整体动物衰老有着密切的关系。 衰老的自由基学说认为，自由基和活性氧随龄累积，损伤蛋白质、核酸等生物大分子并引起结构和功能的改变，最终导致细胞衰老或生物体整体衰老。深入研究衰老的机制，建立适宜的衰老模型，对于寻找和开发延缓衰老的药物具有十分重要的意义。 细胞受到氧化剂刺激、原癌基因导入等会产生细胞衰老的特征，又称作早熟性衰老，其特征与机制和细胞衰老基本一致。本研究分别用H2O2和D-半乳糖建立了细胞衰老的体外模型，并对其衰老机制进行了探讨。同时进行了D-半乳糖致整体动物衰老的实验研究。 格尔德霉素(Geldanamycin)是从链霉菌培养液中分离得到的苯醌安莎类抗生素，具有广泛的抗肿瘤和抗病毒活性。本论文研究了其在Beale犬体内的药代动力学过程。 1.H2O2诱导2BS细胞衰老模型的药物筛选 100μM的H2O2与2BS细胞孵育20h，MTT法检测发现细胞存活率大约下降20％左右。提前2h给予不同浓度的中药单体组分如金银花提取物、板栗提取物以及葛根素、白藜芦醇、常见的抗氧化剂NAC等，2BS细胞的存活率会产生较大变化，而且此变化与给药浓度有关。金银花的提取物JH-34、RB-44、RB-55可使存活率提高20％以上，分别为20.3％、23.0％、21.2％。白藜芦醇、葛根素、NAC也能够使2BS细胞的存活率提高20％以上， 1亚致死量的H2O2处理年轻的成纤维细胞可以产生早老型特征，该模型建立方法简单，检测指标可靠，是筛选延缓衰老药物的良好模型。筛选得到的金银花提取物等具有潜在的开发应用价值。 2.2D-半乳糖致细胞早熟性衰老的机制 用特异的ROS荧光探针H2DCFDA，通过流式细胞术检测了D-半乳糖作用后细胞内ROS水平的变化，结果显示，年轻的2BS细胞或MEF细胞，经D-半乳糖或H2O2作用后，胞内的ROS水平明显升高。当用自由基清除剂NAC共同孵育细胞后，其ROS水平则降低。这表明，D-半乳糖作用于细胞后，细胞内的自由基含量升高，这可能是细胞产生早老的诱因。 为了进一步检测ROS对细胞内蛋白的影响，我们用试剂盒测定细胞内SOD活性和MDA含量。结果提示，细胞经D-半乳糖作用后细胞内MDA含量明显上升，而SOD2活性下降。这提示，这可能是细胞内升高的ROS攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物增多所致，而细胞内SOD活性的下降可能使损伤进一步加剧。 WesternBlot结果表明，2BS细胞经过不同浓度的D-半乳糖处理72h后，P53、P21、P16被上调，CHK2蛋白也被上调，而PCNA表达降低，Rb的磷酸化程度明显降低。 上述结果表明，D-半乳糖诱导细胞衰老的可能机制为：由于D-半乳糖的作用细胞内ROS增加，损伤了DNA和细胞内蛋白，进而使Chk2被激活，激活的Chk2又使P53蛋白表达增加，进而启动P21和P16的功能，使Rb磷酸化程度降低，与E2F因子结合，至此细胞衰老的信号通路被激活，从而引发细胞产生早老。SIRT1蛋白的含量升高，其原因有待进一步探讨。 3.D-半乳糖致小鼠衰老模型的实验研究 D-半乳糖连续皮下注射C57BL/6J小鼠8周，同时腹腔注射葛根素，采用跳台法和水迷宫法检测小鼠的学习记忆能力，发现D-半乳糖模型小鼠学习记忆能力较差；免疫组化结果表明，D-半乳糖模型小鼠大脑皮层和海马中GFAP、NT-3含量增加；体内SOD水平下降、MDA含量升高，而且肝、脑、肾、肌肉组织中P21蛋白表达增高等现象，这可能是细胞衰老在整体动物水平的体现。黄酮类化合物葛根素可以部分拮抗这种改变。 4.格尔德霉素在Beagle犬药代动力学的研究 建立了测定Beagle犬血浆内格尔德霉素的固相萃取-HPLC测定方法，方法学确证实验表明，格尔德霉素的线性范围为0.01～1.0μg·mL-1，r=0.9991。日内和日间精密度分别为均小于10％；回收率在85％～105％之间。 Beagle犬单次静脉注射格尔德霉素，剂量分别为0.25，0.5，1.0mg·kg-1。低、中、高剂量组的T1/2β分别为89.2，116.6，101.6min；AUC分别为6.9，12.7，24.9μg·mL-1·min；CL分别为0.03592，0.03942，0.0401L.mL-1·kg-1，格尔德霉素在Beagle体内的药代动力学符合一级消除二室开放模型动力学特征。

目录

部分缩略语

第一部分 H2O2诱导2BS细胞衰老模型的药物筛选

第二部分D-半乳糖致细胞衰老模型及其机制的探讨

前言

实验材料

实验方法

实验结果

小结

参考文献

第三部分D-半乳糖致小鼠衰老模型的实验研究

第四部分格尔德霉素在Beagle犬药代动力学的研究

综述与讨论D-半乳糖致细胞衰老模型及其机制的探讨

论文结论

附录

致谢