CHO细胞表达人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白研究

摘要

哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优越性。其中，二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO/DHFR-)表达系统应用最为广泛。 在CHO/DHFR-表达系统中，应用弱化DHFR基因(选择基因)表达水平的原理来提高肿瘤坏死因子受体Ⅱ胞外区—人免疫球蛋白IgGFc(TNFR-Fc)融合蛋白分子的表达水平。为此，构建了二种可扩增双顺反子表达载体。二种表达载体只是DHFR基因插入IRES序列之后的位置不同。 转染CHO/DHFR-细胞后，阳性克隆基因组中TNFR-Fc基因检测结果表明，重组质粒已整合到CHO基因组里。在随后通过RT-PCR方法对TNFR-Fc的mRNA转录水平检测，结果表明pT-dhfr2-TRFc组的转录水平比pT-dhfr1-TRFc组高。对阳性克隆数及阳性克隆扩大培养后的表达水平进行比较： 1、pT-dhfr1-TRFc组的克隆数为416±36个，TNFR-Fc表达水平为0.7±0.15mg/L。 2、pT-dhfr2-TRFc组的克隆数为102±18个，表达水平为3.8±0.8mg/L。阳性克隆数pT-dhfr1-TRFc组高，为后者的4.08倍；pT-dhfr2-TRFc组TNFR-Fc表达水平高，为前者的5.43倍。在随后的pT-dhfr2-TRFc组MTX加压条件下培养。MTX在0；20和50nM时，TNFR-Fc表达水平分别为3.8±0.8；7.2±1.1和14.4±2.3mg/L，表达水平最高提高了3.79倍。 电泳分析表明：表达产物TNFR-Fc分子量约为64kd(还原条件)，在非还原条件下，出现分子量约为128kd二聚体主带，还出现了64kd单体次带。活性检测实验显示，表达产物TNFR-Fc具有中和TNF活性，能抑制TNF对L929的杀伤。 构建的可扩增双顺反子表达载体系统，置于IRES前后基因(TNFR-Fc，DHFR)表达存在着不对称性，IRES使同一mRNA中的第二个基因(DHFR)得到翻译，利用位置效应，降低DHFR基因的翻译效率，筛选出转录水平高的克隆，从而实现目的基因TNFR-Fc高效表达的目的。

目录

前言

第一部分可扩增双顺反子表达载体pT-dhfr1-TRFc和pT-dhfr2-TRFc的构建

材料与试剂

实验方法

结果

讨论

第二部分TNFR-Fc在CHO细胞中的表达研究

参考文献

综述 哺乳动物细胞表达系统研究进展

附录一 缩略词

发表文章及专利：

致谢