家蚕表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的研究

摘要

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的累及关节的自身免疫性疾病。研究表明，肿瘤坏死因子TNFα是RA病理机制中的关键因子，重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可溶性肿瘤坏死因子拮抗剂，可特异性地与体内的肿瘤坏死因子(TNFα)竞争性结合，从而抑制TNFα诱发的关节免疫反应，达到治疗类风湿性关节炎的目的。
　　 家蚕杆状病毒表达系统作为一种新的真核表达系统，具有生产成本低、安全性高、高效、表达产物翻译后修饰水平高等优势，是外源蛋白表达研究的理想表达系统。本研究尝试利用家蚕杆状病毒表达系统来表达纯化重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)。
　　 首先，我们利用Bac-to-Bac系统构建了重组转移载体pFast-BacⅠ-(rhTNFR-Fc)，并转化大肠杆菌感受态DH10Bac筛选出重组Bacmid。用脂质体介导法将重组Bacmid转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒vBm-（rhTNFR-Fc）。然后将扩增的F4代重组病毒感染家蚕BmN细胞，接种家蚕五龄幼虫和蚕蛹，经鉴定目的蛋白在BmN细胞、蚕血淋巴和蚕蛹中均得到表达。我们从蚕血淋巴中纯化得到rhTNFR-Fc融合蛋白，利用糖苷酶PNGaseF对纯化后的蛋白进行酶切去糖基化分析，酶切后的rhTNFR-Fc蛋白比去糖基化前小2～3kDa，但比预期分子量还要大，说明rhTNFR-Fc蛋白在该表达系统中得到了N-糖基化修饰，并可能存在O-糖基化修饰。最后，我们采用夹心ELISA法检测融合蛋白rhTNFR-Fc的受体结合活性，并用MTT法检测该蛋白的中和活性，结果表明纯化后的目的蛋白具有很好的体外生物学活性，为接下来研究该蛋白对佐剂型大鼠关节炎模型的治疗效果奠定基础。
　　 本研究证实利用家蚕杆状病毒表达系统可以高效表达并纯化出有生物活性的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)，为该蛋白的高效表达提供了一种新途径，也为在家蚕杆状病毒表达系统中表达其它的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。