基因转录、DNA复制及染色质结构在基因定点修复中的作用及机制研究

摘要

基因治疗是目前治愈人类疾病的最根本方法，但因载体安全性差等问题，其临床应用受到了严重限制。要解决这些问题，首先就是要提高治疗的靶向性，其中最彻底的方法就是原位修复有缺陷的基因，即基因定点修复，它在靶向性、安全性及操作的方便性方面与基因治疗其它方法相比有明显的优势。目前最有希望的定点修复载体是单链寡核苷酸(singlestrandedoligonucleotide，SSO)。以往的工作证实，SSO确有在多系统多层次上完成基因定点修复的能力。但它的主要缺点是修复效率较低，限制了进一步的应用研究。要想提高其修复效率，当务之急就是揭示SSO介导的基因定点修复的作用机制。 本组已经构建了哺乳动物细胞定点修复的荧光报告系统(F5细胞)，并已筛选出了最佳打靶分子(E6)及最佳转染试剂。当把Thymidine作用于F5细胞后，发现修复效率显著提高，因此提出了复制叉渗漏，SSO掺入假说。转录与复制是两个密切联系的过程，尽管转录相关机制研究已取得一定进展，但这些工作都是通过在全基因组范围内调节转录活性而完成的。在这种全局性的调控方式下，最终修复效率的变化是由多种因素改变引起的，不利于进行机制探讨。因此本实验中我们采用了一种特异性的调节靶基因转录的策略，即以靶基因为模板，合成序列特异性的辅助寡核苷酸。因每一条辅助寡核苷酸都可与靶基因上某段特定区域的DNA双链中的一条链互补配对，进而在这个特定的区域内形成一个loop结构。Loop结构形成后，必然会影响到靶基因的转录及复制过程，进而导致修复效率的改变。我们选择了100nt长和25nt长两种长度的辅助寡核苷酸分别与E6一起进行修复实验，发现两组实验的修复效率都有提高。然后，我们把两段25nt长的辅助寡核苷酸作为一个组合，并采用两步转染法进行修复实验，效率提高至对照组的5倍。我们还比较了互补的辅助寡核苷酸的修复效率，结果显示两组的修复效率基本持平。上述实验结果均支持我们设计辅助寡核苷酸的初步设想，即通过形成loop结构，调解靶基因的转录及复制过程，进而改变修复效率。把thymidine和辅助寡核苷酸共同作用于F5细胞后，结果提示最终的修复效率和只用thymidine时的效率基本持平，以这个结果为基础，我们提出了转录复制偶联的修复机制。 丁酸钠作用于F5细胞，修复效率比对照组提高了3倍。当把丁酸钠与辅助寡核苷酸共同作用于F5细胞中，结果显示修复效率比只用辅助寡核苷酸的实验组低。针对此结果，我们认为丁酸钠即可开放染色质结构，又可加快转录速度的特点对定点修复过程既有利又有弊。 本实验中，定点修复过程依旧表现出明显的链偏向性，无论在辅助寡核苷酸或丁酸钠的作用下，总是针对非转录链打靶的分子起效，而与之互补的另一条打靶分子几乎没有修复作用。我们认为此链的偏向性的形成涉及了复制、转录等多种因素的共同作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文名词及缩写

声明

前言

1.基因定点修复概述

1.1基因定点修复基本原理

1.2基因定点修复具有靶向性、安全性及操作的方便性

2.基因定点修复研究进展

2.1 RDO介导的嵌合体修复术

2.2 SSO介导的基因定点修复

2.3 SSO介导的基因定点修复的基本分子过程

2.4 SSO定点修复的分子机制

3.本实验设计概述

材料

1.菌株和质粒

2.细胞系

3.转染试剂

4.寡核菅酸

5.药物

6.其它主要试剂及试剂盒

7.主要仪器设备

方法

实验流程图

1.细胞培养

1.1 G418溶液配制

1.2细胞生长条件

1.3细胞传代

1.4复苏及冻存

1.5台盼兰计数活细胞

1.6细胞记数法

2.Thymidine及丁酸钠溶液的配制

3.Lipofectamine 2000法转染DNA

4.设计辅助寡核苷酸

5.辅助寡核苷酸介导的基因定点修复

5.1一步转染法

5.2两步转染法

5.3 thymidine或丁酸钠作用下的两步转染法

6.Thymidine及丁酸钠作用下的基因定点修复

7.荧光显微镜下观察基因定点修复的发光细胞

8.FACS定量分析发光细胞比例

实验结果

1.通过辅助寡核苷酸调节基因转录提高定点修复效率

1.1实验一、100nt长辅助寡核苷酸

1.2实验二、25nt长辅助寡核苷酸

1.3实验三、两段25nt长辅助寡核苷酸共同参与基因定点修复

1.4实验四、与非转录链配对的辅助寡核苷酸参与的基因定点修复实验

1.5不同长度辅助寡核苷酸作用下修复效率的比较

2.利用丁酸钠活化细胞染色质结构提高定点修复效率

3.DNA复制、基因转录及染色质结构对于定点修复的综合作用研究

3.1丁酸钠与辅助寡核苷酸共同作用的定点修复

3.2 thymidine与辅助寡核苷酸共同作用的定点修复

4.SSO分子的链偏向性分析

4.1辅助寡核苷酸作用下，链的偏向性分析

4.2丁酸钠作用下，链的偏向性分析

讨论

1.靶基因特异性转录调节促进定点修复反应

1.1特异性转录调节对于寡核苷酸修复的必要性

1.2以R-LOOP原理设计辅助寡核苷酸调节基因转录

1.3短片段辅助寡核苷酸可以提高定点修复效率

1.4辅助寡核苷酸参与基因定点修复实验的总结

2.基因定点修复的复制转录动态偶联

3.染色质结构变化影响定点修复过程

3.1染色质结构的周期性变化

3.2采用丁酸钠处理细胞可提高修复效率

3.3丁酸钠抵销了辅助寡核苷酸的部分作用

4.基因定点修复中SSO作用呈链的偏向性

4.1转录相关的链的偏向性

4.2复制相关的链的偏向性

5.SSO介导的基因定点修复是一个复杂的分子过程

6.本实验的优势及创新性

7.本实验的不足及进一步的设想

小结

参考文献

文献综述Molecular Characteristics of Targeted Gene Repair Mediated by Modified Single-Stranded DNA Oligonucleotide

致 谢

个人简历及发表的文章