羟基红花黄色素A促大鼠局灶性脑缺血后血管新生作用的分子基础初探

摘要

目的： 促脑卒中后的血管新生治疗是近年来抗脑缺血药物研究的热点之一。羟基红花黄色素A(hydroxysaffior yellow A，HSYA)是传统活血化瘀中药红花的主要活性成分之一。我们前期研究结果提示HSYA可能通过促进血管新生而发挥脑保护作用，本研究旨在对其促脑缺血后血管新生的早期分子基础做初步探讨。 方法： 1. 建立线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，设缺血后6h、12h、24h三个时间点，每个时间点分为假手术组(n=8)、模型组(n=8)、阳性对照药组(MK801 0.5mg/kg，n=8)和HSYA治疗组(60mg/kg，n=8)。缺血后即刻舌下静脉给药，HSYA组以一个半衰期(30min)为间隔连续给药5次(每次12mg/kg)，总给药剂量60mg/kg。于脑缺血后6h、12h和24h三个时间点分别观察HSYA对脑缺血大鼠神经行为障碍和MCAO大鼠脑梗死体积的影响。 2．以MCAO大鼠为模型，设缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h五个时间点，每个时间点分为假手术组、模型组和HSYA治疗组(n=3)，给药方法同上。选用包括与血管新生密切相关的生长因子、生长因子受体、黏附分子、转录因子等113个基因的血管生成功能分类基因芯片，检测HSYA在各个时间点对大鼠缺血侧皮层半暗带中血管新生相关基因转录水平的影响。使用综合型GEArray表达分析配套软件进行完整的芯片数据分析。 3．在分析基因芯片结果的基础上，应用RT-PCR法观察HSYA对线栓法致急性脑缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGF、Flt、bFGF、aFGF五个血管新生密切相关基因的mRNA表达的影响，以GAPDH为内参，结果采用图像分析软件进行半定量分析。同时采用实时定量PCR法分析HSYA对大鼠急性脑缺血后3h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGFmRNA表达的影响。以GAPDH为内参，获得HIF-1α、VEGF mRNA的相对含量做组间比较。 4．采用Western Blotting法分别观察HSYA对线栓法致急性脑缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGF、Fit、bFGF、aFGF蛋白表达的影响，以GAPDH为内参，结果采用图像分析软件进行半定量分析。 结果： 1. 与假手术组相比，缺血后6h、12h和24h，模型组大鼠神经行为障碍明显，脑梗死体积显著增加，阳性对照药MK801静脉给药明显改善脑缺血动物神经症状，减小脑梗死体积(P<0.05)；HSYA给药组各个时间点动物神经行为症状均得到明显改善，脑梗死体积显著减小(P<0.05)。 2．基因芯片结果提示，与假手术组比较，缺血24小时内：MCAO模型组有75个基因表达发生显著变化，其中19个显著上调，56个显著下调；大部分血管新生激活基因(如缺氧诱导因子、酸性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等)在缺血后有不同程度的表达下调；IL-1β、MCP-1等炎症和趋化因子基因持续上调；抗炎细胞因子IL-10在缺血后3h和24h显著下调。而HSYA给药组，有85个发生显著变化，其中58个显著上调，27个显著下调。上调最为明显的是血管新生诱导因子基因(如HIF．1α、VEGF、aFGF、Ang2等)和炎症相关因子基因(如IL-6、IL1β、IL-10等)；下调的有凝血酶敏感素等基因。 3. RT-PCR和实时定量PCR结果综合显示，与假手术组比较，缺血后3小时模型组脑皮层半暗带的VEGF、HIF-1α、Flt、bFGF基因表达有显著下调(P<0.05)，而HSYA可使aFGF、bFGF、Flt、HIF-1αmRNA表达明显上调(P<0.05)；缺血后24h，在模型组中HIF-1α、Flt mRNA表达上调的基础上，HSYA可使bFGF、VFGF mRNA表达显著增加(P<0.05)。 4．蛋白免疫印迹研究显示，MCAO后24h内，HSYA可先后使缺血侧脑皮层半暗带HIF-lα、Flt、aFGF、bFGF蛋白的表达显著上调，与模型组比较有显著差异(P<0.05)，其上调作用具有不同的时相性。HSYA可上调VEGF的蛋白表达，但与模型组比较未见显著差异。 结论： 基因芯片结果提示内源性的促血管新生相关基因的表达在脑缺血后24h内经历了一个先下降后上调的动态过程，同时提示HSYA促血管新生早期的分子作用机制是一个多因子多通路参与的网络化过程，其中对血管新生相关基因(如HIF-1α、VEGF、aFGF、Ang2、Ephrin-A1等)的上调作用可能是其分子基础之一。在基因芯片的基础上，通过分子生物学技术初步证实aFGF、bFGF、Flt、HIF-1α、VEGF等因子在转录和蛋白水平的上调可能是HSYA促血管新生的主要分子基础。HSYA对于其它血管新生基因的调控作用还有待进一步实验的探讨。以上结果既为前期观察到的血管新生现象提供了分子水平的解释，又为下一步更深入的探讨HSYA促血管新生的作用机制提供了靶标。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

研究背景

1脑缺血与治疗性血管新生研究的概述

1.1脑缺血与血管新生

1.2脑缺血与血管新生诱导因子

1.3脑缺血后治疗性血管新生治疗的研究进展

2红花及其所含小分子化合物羟基红花黄色素A的研究

2.1红花研究的简介

2.2羟基红花黄色素A促治疗性血管新生的前期研究成果

3基因芯片与脑缺血

3.1基因芯片的概述

3.2基因芯片技术与抗脑缺血药物分子作用机制

3.3基于基因芯片技术探讨羟基红花黄色素A促治疗性血管新生的分子机制

第一章羟基红花黄色素A连续给药对急性脑缺血大鼠脑梗死体积和行为障碍的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

4.1关于脑缺血模型的选择

4.2 HSYA连续给药方式的尝试

小结

第二章采用功能分类基因芯片技术探讨HSYA促治疗性血管新生作用的分子基础

1实验材料

2实验方法

2.1动物分组及给药

2.2急性局灶性脑缺血MCAO大鼠模型的制备

2.3取材

2.4 Oligo GEArray功能分类基因芯片实验操作程序

3功能分类基因芯片结果与讨论

3.1脑组织总RNA提取和纯化

3.2 HSYA对血管新生相关基因转录水平的影响

小结

附表及附图

第三章：HSYA对MCAO后24小时内大鼠脑组织皮层半暗带HIF-1α、VEGF、Flt、aFGF、bFGF基因转录水平的影响

1实验材料

2实验方法

3.实验结果

3.1 PCR法扩增MCAO后不同时间点大鼠脑组织mRNA表达预实验

3.2 HSYA对MCAO后24小时内脑组织皮层半暗带HIF-1α、VEGF、Flt、aFGF、bFGF基因转录水平的影响

3.3芯片杂交与RT-PCR结果比较

4讨论

4.1对基因芯片结果的补充：HSYA对Flt-1、bFGF转录水平的影响

4.2对基因芯片结果的验证：HSYA对HIF-1α、VEGF、aFGF转录水平的影响

第四章：实时定量PCR方法检测HSYA对HIF-1α、VEGF转录水平表达的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

3.1 HSYA对MCAO后24小时内大鼠脑组织皮层半暗带VEGF、HIF-1α转录水平的影响

3.2实时定量PCR、芯片杂交与RT-PCR三者的结果比较

4讨论

第五章：羟基红花黄色素A对急性局灶性脑缺血大鼠脑皮层半暗带HIF-1α、VEGF、Flt-1、bFGF、aFGF蛋白表达的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第六章综合讨论

1脑缺血急性期内源性血管新生因子的表达

2 HSYA对脑缺血急性期内源性血管新生因子表达的影响

2.1 HSYA与VEGF及其受体系统

2.2 HSYA与缺氧诱导因子

2.3 HSYA与成纤维细胞生长因子

2.4 HSYA与Ang/Tie-2系统

2.5 HSYA与Ephrin/Eph系统

2.6 HSYA与炎症相关基因

2.7 HSYA与其它血管新生诱导因子

3本研究的不足之处

4展望

参考文献

CURRICULUM VITAE

致 谢