FcαR在中性粒细胞的亚细胞定位和FcαR剪接体表达分析&依赖于FcαR的双特异性分子在自身免疫疾病治疗中的初步探索

摘要

本论文分为三部分，第一部分研究了FcαRI(CD89)在中性粒细胞中的亚细胞定位和FcαR的剪接体表达及功能。 人FcαRI(CD89)在机体免疫防御中发挥着十分重要的作用。FcαR表达于髓系细胞，其中中性粒细胞是数目最大的FcαR阳性细胞。前人研究表明FcαR存储于中性粒细胞的颗粒内，并随其激活而快速调动至细胞膜上。但是，到目前为止还不清楚FcαR在中性粒细胞中的亚细胞定位。本课题通过流式细胞分析、颗粒组分分离、ELISA鉴定、颗粒的调动、共聚焦荧光显微镜共定位和Western blot分析，证明了FcαR定位于中性粒细胞的细胞膜、分泌小泡和三级颗粒。储存于分泌小泡中的FcαR与储存于三级颗粒中的FcαR分子量大小不同。分泌小泡中FcαR的分子量为55-75 kDa，而三级颗粒中其分子量为50-70 kDa。使用去N-糖基化酶PNGase F处理后，分泌小泡中FcαR的核心分子量为32 kDa，这与文献报道的全长FcαRI相一致，而三级颗粒FcαR的核心分子量为29-30 kDa，可能是一种小的FcαR剪接变体，其生理学功能需要进一步研究。 通过RT-PCR分析和DNA测序鉴定，我们发现人前髓细胞HL60在不同的分化阶段表达不同的FcαR的剪接形式。在分化早期，HL60主要表达剪接体a.3，其可以结合IgA；而在分化晚期，HL60不仅表达剪接体a.3也表达全长的FcαRI。 第二部分和第三部分主要对双特异性分子在自身免疫疾病的治疗作用进行了初步探索。 近年来，基于Fc受体的双特异性分子(BiM)在疾病治疗中的作用越来越受到人们的重视。本课题探索了双特异性分子治疗重症肌无力(myasthenia gravis，MG)可能性，最初的设想是利用双特异性分子去除自身反应性B细胞。主要原理是构建由自身抗原和抗Fc受体抗体组成的双特异性分子，这种双特异性分子能够同时结合识别自身抗原的自身反应性B细胞和表达Fc受体的效应细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞等)，从而效应细胞能够选择性地杀伤自身反应性B淋巴细胞，而对正常B细胞没有杀伤作用，最终达到靶向治疗的作用。为此首先建立了表达抗自身抗原膜表面抗体的自身反应性B细胞。MG的发病机制与自身抗体和神经肌肉接头处突触后膜烟酰胺型乙酰胆碱受体(AchR)的结合密切相关。我们摸索了多种策略来表达具有功能活性的AchR膜外区蛋白，并获得了复性的蛋白，将其免疫Lewis大鼠，建立了MG的动物模型(EAMG)。然后我们以EAMG脾细胞与骨髓瘤细胞融合，制备了大鼠抗nAchRα ECD的单克隆抗体，这些杂交瘤细胞同时也表达膜表面免疫球蛋白(mIg)，因而可以作为BiM模型所需的自身反应性B淋巴细胞。然后，以化学交联的方法构建了双特异分子MIP8aF(ab’)<,2>-19p。FACS分析显示该双特异分子能同时结合表达Fc受体的U937细胞和识别19肽的杂交瘤细胞。FACS和共聚焦荧光显微镜分析显示，MIP8aF(ab)<,2>-19p可以介导MDM对表达mlgB细胞的吞噬作用。此研究为基于FcαR双特异分子的自身免疫疾病的免疫治疗提供了科学依据。

目录

论文说明：英文缩略语对照表

摘要

实验结果和讨论

第一部分 FcαRI(CD89)在中性粒细胞中的亚细胞定位和FcαR的剪接体表达及功能研究

前言

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 α1-nAchR ECD蛋白的表达以及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得

前言

实验结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 依赖于FcαRI(CD89)的双特异性分子的构建及其活性研究

前言

实验结果

讨论

小结

参考文献

实验材料和实验方法

一、实验材料

(一)主要化学试剂

(二)抗体

(三)实验动物

(四)细胞系

(五)工具酶、分子量标准及试剂盒

(六)质粒载体

(七)菌株

(八)构建克隆的通用引物

(九)仪器设备

(十)软件

二、实验方法

【分子生物学相关实验】

【常规免疫学相关实验】

【常规生物化学方法】

【免疫学及细胞生物学功能研究实验】

综述依赖于Fc受体的双特异性分子在疾病靶向治疗中作用的探索

附录

致谢