60kD SSA/Ro抗原不同表位ScFv抗体对相关自身免疫病致病机制的研究

摘要

[研究背景] 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗R060抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60抗原拥有20个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗Ro60抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据R060蛋白20个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨Ro60不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗Ro抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成Ro60抗原3个表位多肽(P1表位：482～493，P2表位：310～323，P3表位：230～241)，用3个多肽从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得3个ScFv单抗<'[17]>。为了能直接观察这3个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体Fc片断的ScFv单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将ScFv单抗与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的PE40片断重组融合为免疫毒素ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨Ro60抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 [研究目的] 1．获取R060抗原3个不同表位的ScFv单抗与毒素PE40的重组融合蛋白(免疫毒素EPlP、EP2P和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗P1、P2、P3及毒素蛋白PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2．Ro60抗原3个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c鼠的重要脏器损害。 3．正常BABL/c鼠体内，抗R060抗原3个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 [方法] 1．用PCR方法扩增：R060抗原3个表位的ScFv单抗序列、PE40序列，并将扩增的3个ScFv分别与PE40连接(ScFv-PE40)，将3个ScFv-PE40、3个ScFv、1个PE40片断分别插入载体pET32a(+)，获得7个表达克隆，DNA测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2． IPTG诱导7个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂IPTG的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3．用NTA-Ni亲和层析柱纯化7种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中4种蛋白(3个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4．使用ELISA方法鉴定6个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P和EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将4个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EA．hy 926)，MTT法测定4种蛋白的细胞毒活性。 5．48只正常BALB/c鼠随机平均分为8组，分别间隙尾静脉注射7种经鉴定的重组蛋白和PBS共2周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规HE染色后病理检查，并分析检查结果。 [结果] 1．获得7种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3分别特异性识别R060抗原表位482～493、310～323、230～241，重组蛋白EP1P、EP2P、EP3P和EPE40均具有明显的细胞毒活性。 2．动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片HE染色检查结果正常，但EP1P处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 [结论] 1．成功获得R060抗原3个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P和EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3单抗及PE40毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2．初步动物实验的结果显示：所研究的3个R060抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分R060表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3．实验获得的3个Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。

目录

论文说明：英文缩略词

引言

材料和方法

一、实验材料

二、技术路线

三、实验步骤

第一部分 Ro60 3个不同表位Pn-PE40-pE40-pET32a(+)、Pn-pET32a(+)及PE40-pET32a(+)克隆的构建及鉴定

第二部分 Pn、PnPP、PE40蛋白表达、纯化及纯化后酶切、再纯化

第三部分 纯化蛋白的成分和功能鉴定

第四部分 Ro60不同表位的免疫毒素对正常小鼠的影响

实验结果

第一部分 Pn-pET32a(+)、Pn-PE40-pET32a(+)、PE40-pET32a(+)各克隆构建

1.预备实验：

2.片断P1、P2、P3、PE40的PCR扩增、回收、酶切、插入载体连接：

3.0Pn-pET32a(+)各克隆的构建：

4.各克隆表达前的基因结构分析：

第二部分 Pn、PnPP、PE40蛋白表达、纯化及纯化后酶切、再纯化

第三部分 纯化蛋白的成分和功能鉴定

第四部分 Ro不同表位抗体的免疫毒素对正常小鼠的作用结果

讨论

第一部分 Pn-pET32a(+)、PE40-pET32a(+)、Pn-PE40-pET32a(+)克隆的构建

第二部分 载体融合蛋白ScFv、PE40、ScFv-FE40的表达、纯化以及酶切后再纯化。

第三部分 纯化蛋白的成分及功能鉴定

第四部分 初步动物实验：Ro60 3个不同表位的免疫毒素对正常BALB/c鼠的影响

结论

论文参考文献

综述：60kD SSA/Ro自身抗原的研究进展

致谢