抗帕金森病新药的发现与评价

摘要

帕金森病是一种锥体外系功能障碍引起的慢性神经退行性疾病，病理特征是脑黑质致密体部位多巴胺能神经元变性，纹状体内多巴胺递质含量显著减少，导致黑质纹状体多巴胺能神经功能低下而胆碱能神经功能相对占优势，从而产生运动障碍。帕金森氏病在60岁以上的人群中的发病率高达1％。导致多巴胺神经元变性的原因迄今不明，目前认为，遗传、感染、免疫功能异常、衰老、体内外的神经毒素等因素对帕金森氏病发病均起一定的作用，而氧化应激和线粒体功能受损在帕金森氏病的发病中有十分重要的作用。 目前已有的抗帕金森病药物只起改善症状的作用，不能延缓疾病的进程，不能预防多巴胺能神经元的退变，且长期应用有严重的毒副作用，而且可能恶化疾病，因此急需有效的治疗药物。近年来，帕金森氏病药物治疗由直接补充多巴胺转向多环节治疗，重点集中于对多巴胺能神经元的保护作用。 第一章：抗帕金森病新药筛选根据帕金森病的发病原因和病理机制 本实验建立了氧化应激相关的6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞保护模型和类神经生长因子的小分子活性化合物的筛选模型，这两个模型分别从不同的作用机制来反应药物的作用。6-OHDA是一种选择性损伤多巴胺能神经元的毒素，此模型可以特异性的筛选出对多巴胺能神经元有保护作用的药物。神经生长因子是目前帕金森病最有效的神经保护治疗剂，但由于其蛋白质性质，限制了临床应用，此模型可以特异性的筛选出类NGF的小分子化合物。通过对560个黄酮类天然产物的筛选，结果发现了三个同时具有较强的抗6-OHDA损伤和促PC12细胞分化作用的化合物。本实验选取在这两个模型中活性均最强的化合物DL0705进行下一步的研究。进一步细胞实验结果显示，化合物DL0705能剂量依赖性的减轻6-OHDA致SH-SY5Y细胞的活力下降，减轻6-OHDA致SH-SY5Y的凋亡；能剂量依赖性的减轻6-OHDA致PC12细胞损伤的作用，并有明显的促进正常和6-OHDA损伤情况下PC12细胞分化和轴突生长的作用。 DL0705的主要成分是黄芩素。黄芩素(黄芩苷元，Baicalein)是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的有效成分之一，具有多种药理作用，如：抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗肿瘤、抗凝、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用。最近的研究报道黄芩素可以预防Aβ诱导的皮层神经元的损伤，可以预防6-OHDA和LPS诱导的多巴胺能神经元的损伤。这些研究结果提示黄芩素可能是一个有效的治疗神经退行性疾病的化合物，为了探讨DL0705在帕金森病中的应用前景，本研究进一步采用三种不同的帕金森病动物模型，从动物行为学、脑内神经递质含量、多巴胺能神经元数目、氧化损伤等方面，对DL0705作为神经元保护药物用于抗实验性帕金森病的作用及机制进行探讨。 第二章：DL0705对小鼠MPTP帕金森病模型的作用及机制研究 本章采用C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP建立亚急性帕金森病动物模型，通过检测小鼠的行为学特征，黑质中多巴胺能神经元数目和纹状体中的单胺类递质的变化来评价DL0705对帕金森病小鼠的影响，同时通过检测氨基酸类神经递质，MPTP损伤通路中的多巴胺转运体(DAT)，胶质源性纤维蛋白(GFAP)，单胺氧化酶(MAO-B)，乙酰胆碱酯酶(AchE)和氧化应激等多种相关指标来探讨DL0705可能的作用机制。 结果显示，DL0705可显著改善MPTP所致的小鼠自发活动下降(P＜0.05)，缩短MPTP所致的小鼠爬杆时间延长(P＜0.05)；DL0705可显著预防MPTP所致的多巴胺类递质DA和HVA下降(P＜0.01)，预防5-羟色胺和肾上腺素类递质含量下降(P＜0.05)，而对氨基酸类递质的影响不大(P＞0.05)；DL0705可使TH阳性神经元数目和多巴胺转运体数目增加20％左右；DL0705可抑制炎症反应，如显著抑制星形胶质细胞反应性增生(P＜0.01)，抑制氧化应激反应，如显著降低脂质过氧化水平(P＜0.05)，增强脑组织中抗氧化酶GSH-Px的活性(P＜0.05)，可显著降低一氧化氮水平(P＜0.05)，有降低MPO活性的趋势，从而起到保护多巴胺能神经元的作用。比较DL0705和美多芭在此模型中的作用，结果显示DL0705与美多芭作用特点不同，DL0705不仅对多巴胺类递质产生影响，而且对5-HT和肾上腺素类递质也产生影响；除此之外，DL0705的抗氧化作用也在帕金森病中起了重要的作用。 第三章：DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠模型的作用及机制研究 本章采用6-OHDA前脑内侧束两点定位注射法建立偏侧帕金森病大鼠模型，造模后2周，通过检测阿朴吗啡诱导的大鼠旋转行为，选取旋转圈数≥240转/40min的大鼠作为造模成功的大鼠。然后随机分组进行药物治疗，分别在给药后1周、2周和3周检测大鼠的旋转行为，在给药3周后同时进行自发活动和肌电测定，通过单胺类递质的变化和多巴胺能神经元数目多少来评价DL0705在体内的活性和药效。然后通过检测氨基酸类递质含量，多巴胺转运体(DAT)，胶质源性纤维蛋白(GFAP)，单胺氧化酶(MAO-B)，乙酰胆碱酯酶(AchE)和氧化应激等多种相关指标来探讨DL0705可能作用的机制。 结果显示，造模两周后，绝大多数大鼠出现了阿朴吗啡诱导的旋转行为，但只有60％的动物模型成功(≥240r/40min)。而DL0705给药3周并未降低阿朴吗啡诱导的旋转(P＞0.05)，对自发活动虽有一定的改善作用，也未达显著性差异(P＞0.05)。但DL0705可显著改善帕金森病大鼠的肌电活动，降低震颤的频率和幅度(P＜0.01)。6-OHDA使纹状体的多巴胺类递质降低了98％以上，由于损伤严重，DL0705虽然对多巴胺类递质虽然有一定的改善作用，但均未达显著性差异(P＞0.05)。6-OHDA使黑质中的多巴胺能神经元数目降低了95％以上，因此，DL0705也未显示出其显著的保护作用(P＞0.05)。但总的结果表明，DL0705还是对帕金森病有一定的改善趋势，其主要作用可能与有增加单胺类递质如DA、HVA和5-HT水平的趋势，可抑制氧化应激，如可显著抑制脂质过氧化水平(P＜0.05)，显著增加抗氧化酶GSH-Px水平(P＜0.01)，有降低MPO活性的趋势，显著抑制星形胶质细胞反应性增生(P＜0.01)有关，但这些仍然不能很好的解释其对肌电的改善作用。根据肌电产生的病理机制，除DL0705对多巴胺能神经元的保护作用可减轻震颤外，也不排除外周的作用参与。本实验进一步考察了DL0705对外周神经传导速度的影响，结果发现DL0705对外周神经传导速度有一定的抑制作用。 第四章：DL0705对氧化震颤素致小鼠震颤的作用研究 多巴胺和胆碱能系统的失衡是帕金森病的一个重要的病理机制。为了考察DL0705对胆碱系统的作用，本章采用小鼠腹腔注射氧化震颤素建立小鼠震颤模型，通过检测小鼠的肌肉震颤和腺体分泌情况来评价DL0705对胆碱系统的影响。 结果显示，氧化震颤素可直接激动M受体从而引起震颤。小鼠腹腔注射氧化震颤素后，肌肉震颤明显可见，全身腺体分泌增加(P＜0.05)，而未见DL0705对震颤程度的抑制作用(P＞0.05)，也未见其抑制腺体分泌的作用(P＞0.05)。结合前两个模型，DL0705对乙酰胆碱酯酶活性无影响的结果，因此，胆碱系统并不是DL0705作用的主要靶系统，但还需进一步的实验来验证。 第五章：黄酮类化合物及其组合抗帕金森病作用比较及机制探讨 总结前面的实验结果，本研究发现DL0705的抗炎和抗氧化作用在帕金森病中发挥了重要的作用，而抗炎和抗氧化作用是黄酮类化合物的共同特性。本章旨在探讨DL0705的抗帕金森病作用是其特有的作用还是结构相似的黄酮类物质的一般特性。基于黄酮类化合物抗氧化作用的构效关系和前期高通量筛选的结果，本研究选取了另外两种化合物DL0407和DL0609，研究它们单用和合用在三种不同的帕金森病动物模型中的作用。 结果显示，这两种化合物无论单用还是合用均表现出不同程度的抗帕金森病的作用。DL0609单独应用不仅强于DL0407和DL0705的单独作用，而且强于DL0407和DL0609合用的效果，这一方面可能与其强的抗氧化作用有关，另一方面它还对胆碱能系统具有一定的影响。基于相加和协同作用的理论，可以推测黄酮类化合物之间的作用可能为相加作用，可能通过相同或相似的机制起作用。因此，虽然黄酮类化合物的抗氧化性质非常重要，但这不可能是它们产生效应的唯一解释。综合现已报道的黄酮类化合物的中枢作用机制，发现他们主要作用于多巴胺，5-羟色胺，胆碱，肾上腺素等受体，这可能是黄酮类化合物在抗帕金森病作用时起效较快的一种解释，而且也可能是通过作用于受体来增加单胺类递质的含量，且增加的5-HT和肾上腺素也是促进PC12细胞分化和轴突生长的一种解释。结合本实验一些相关工作，认为“一种活性化合物，一种作用机制”的观点已经不成立。黄酮类化合物属于多靶点药物，因此需要从多方面去分析其作用机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表(ABBREVIATIONS)

声明

第一章 抗帕金森病新药筛选

前言

第一节抗帕金森病约物筛选和活性化合物的确定

1.筛选模型的选择及其理论依据

2.抗帕金森病药物筛选

3.筛选结果

第二节DL0705筛选结果的确证

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.小结

参考文献

第二章DL0705对MPTP致帕金森病小鼠的作用及机制研究

前言

第一节DL0705对MPTP致帕金森病小鼠的行为学影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二节 DL0705对MPTP致帕金森病小鼠纹状体单胺类递质的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第三节 DL0705对MPTP致帕金森病小鼠纹状体氨基酸类递质含量的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第四节 DL0705对MPTP致帕金森病小鼠脑黑质TH，DAT，GFAP以及a-synuclein蛋白表达的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第五节 DL0705对MPTP致帕金森病小鼠脑组织MAO-B和AchE活性的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第六节 DL0705抗MPTP致帕金森病小鼠脑组织氧化损伤的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第七节DL0705对MPTP致C57BL/6小鼠脑组织NO和NOS的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第八节 DL0705和美多芭在MPTP致帕金森病小鼠模型中的作用特点比较与分析

1.DL0705和关多芭在MPTP所致帕金森病小鼠模型的特点比较

2.结论

参考文献

第三章 DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠的作用及机制研究

前言

第一节 DL0705对6-OHDA偏侧损伤所致帕金森病大鼠的行为学影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二节DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠损毁侧纹状体单胺类递质的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第三节DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森大鼠损毁侧纹状体中氨基酸类递质的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第四节 DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠损毁侧黑质TH，DAT和GFAP蛋白表达的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第五节DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠损毁侧脑组织MAO-B和AchE活性的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第六节DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠损毁侧脑组织氧化损伤的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第七节DL0705对6-OHDA偏侧损伤致帕金森病大鼠损毁侧脑组织NO和NOS的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第八节 DL0705对正常大鼠外周神经传导速度的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第九节 DL0705和美多芭在6-OHDA偏侧损伤大鼠帕金森病模型中的作用比较与分析

1.DL0705和美多芭在6-OHDA偏侧损伤帕金森病大鼠模型的比较

2.结论

参考文献

第四章DL0705对氧化震颤素致小鼠震颤的作用研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 DL0705对氧化震颤素引起小鼠震颤的影响

3.2 DL0705对氧化震颤素致小鼠腺体分泌的影响

4.讨论

参考文献

DL0705抗帕金森病作用特点分析

第五章 黄酮类化合物及其组合抗帕金森病作用比较及机制探讨

前言

第一节 相关化合物及组合抗帕金森病作用的比较研究

1.相关化合物选择的依据

2.相关化合物及组合抗帕金森病的药效学比较研究

3.结论

第二节 黄酮类化合物抗帕金森病作用机制探讨

1.黄酮类化合物中枢作用机制研究现状

2.相关黄酮类化合物中枢作用机制总结

参考文献

本研究的创新点及不足之处

第六章 帕金森病治疗药物研究新进展

相关工作

致谢

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