重组ss-RVE1突变体融合蛋白的表达、纯化及免疫学性质研究

摘要

风疹病毒(RubellaVirus，RV)是一种包膜病毒(Togaviridae)，是唯一一种风疹病毒亚属(Rubivirus)病毒。风疹病毒可以引起相对较为温和的儿科疾病--德国麻疹(Germanmeasles)，感染风疹病毒通常可以导致由T淋巴细胞和抗体介导的长期免疫。成年人感染风疹病毒可能引起短暂或慢性关节炎、肌肉与骨骼的综合征、胰岛素依赖糖尿病和迟发的神经系统后遗症。在孕早期，风疹病毒是主要的干扰因素之一。母亲在妊娠期感染风疹病毒，胎儿有发生先天性风疹综合征(Congenitalrubellasyndrome，CRS)的风险。CRS的临床症状包括白内障、心脏缺陷和耳聋等，这就意味着要选择IgM和IgG抗体特异的风疹病毒抗原。风疹病毒包膜糖蛋白E1和E2介导细胞嗜性，E1在病毒与受体小体膜融合过程中发挥极其重要的作用，这两个蛋白均是体液免疫应答的首要靶蛋白。通常用于血清学检测抗风疹病毒免疫球蛋白的是重组风疹病毒E1外功能区突变体蛋白或制备自病毒溶胞产物的E1抗原。到目前为止，应用于诊断目的的重组E1抗原主要是通过真核表达系统产生的。 研究目的：构建、表达、纯化一种高产率基因工程重组E1外功能区抗原(ssRVE1)，ssRVE1表达自大肠杆菌细胞质。这种抗原可以简单有效地复性为高可溶性和免疫反应构象。 研究方法：人工合成一段cDNA序列ssRVE1，其5’端编码两个分子伴侣SlyD(aa1～165)，3’端编码风疹病毒E1外功能区片段aa201～432，构建入原核表达载体pET-24a(+)。通过IPTG诱导，所构建的原核表达质粒pET24a-ssRVE1在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达。使用金属离子螯合层析纯化原核表达的融合蛋白ssRVE1并在柱上复性重折叠。纯化后的ssRVE1通过ELISA实验分析其免疫学性质。 结果：经过复性重折叠的ssRVE1突变体融合蛋白明显提高了风疹病毒E1外功能区表达的可溶性、稳定性以及应用于ELISA检测抗风疹病毒IgG实验的灵敏度，但是也同时提高了其检测的假阳性率。为了增强重组E1突变体抗原的表达效率，实现体外重折叠，提高总体的可溶性，在重组风疹E1外功能区的氨基末端融合表达了两个功能单位大肠杆菌来源的SIyD(aa1～165)。ELISA结果显示个别血清样本可以与SIyD结合，这可能是造成假阳性率升高的原因。做为融合蛋白的一部分，E1外功能区片段aa201～432采用了有免疫反应活性的折叠方式。在E1外功能区毗邻膜的两个二硫键对于形成敏感、特异的抗原性构象是非常必要的。 结论：异源免疫学实验表明共价结合的分子伴侣分子不会削弱抗体识别并结合风疹病毒E1蛋白。很显然，SlyD和相关的助折叠分子对于表达并重折叠那些在诊断中或有重要医学价值的不容易得到的蛋白是一种通用的工具，为敏感、特异的血清学检测抗风疹病毒E1IgG提供了一种有应用前景的工具。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分：pET24a-ssRVEl表达质粒的构建

1 实验目的

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果

3.1人工合成ssRVE1

3.2 pET-24a(+)载体线性化

3.3构建原核表达质粒pET24a-ssRVE1

3.4构建原核表达质粒pET24a-RVE1

3.5构建原核表达质粒pET24a-SIyD

4 小结

第二部分：重组ssRVEl突变体融合蛋白的表达和纯化

1实验目的

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果

3.1重组ssRVE1、RVE1和SlyD蛋白的表达与鉴定

3.2重组ssRVE1、RVE1和SlyD蛋白的纯化

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化的重组ssRVE1、RVE1、SlyD蛋白纯度

3.4.非变性蛋白质电泳分析重组ssRVE1、RVE1、SlyD蛋白构象

4 小结

第三部分：重组ssRVE1突变体融合蛋白的免疫学性质研究

1实验目的

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

4 小结

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢