ROS效应蛋白Nrf2介导α-珠蛋白稳定蛋白(AHSP)在β-地贫状态下的反馈升高

摘要

地中海贫血是人类最为常见的单基因遗传性疾病之一。当珠蛋白基因发生突变时，一种或多种珠蛋白肽链的合成受阻，最终导致α-珠蛋白肽链和β-珠蛋白肽链的合成不平衡。游离的珠蛋白肽链是强氧化剂，可以催化产生活性氧自由基ROS。ROS的产生可以破坏红系前体细胞和成熟的红细胞，严重时可导致凋亡。凋亡的红系前体细胞累积即可导致无效的红系生成，其症状即为贫血。另外，游离的珠蛋白不稳定而易发生沉淀或降解。珠蛋白在红细胞膜上的沉淀会破坏细胞膜导致溶血性贫血。降解的珠蛋白释放有毒的血红素、卟啉和铁离子等，这些游离的离子也会催化产生ROS。ROS的产生是关于地中海贫血的分子病理学的重要内容。
　　 目前关于地中海贫血的治疗主要分为三类，输血、利用铁螯合剂去除血液中过量的铁离子和利用激素进行内分泌调节等方法是对症治疗，可以在一段时间内减轻地中海贫血的临床症状，但需终生用药；而通过异体骨髓移植、药物开启胎儿型珠蛋白基因的表达和利用抗氧化剂等方法则是从病因出发，可以在一定程度上改善地中海贫血症状，但仍面临排异反应，药物毒性等因素的困扰；另外有关地中海贫血基因治疗的方法也在艰难探索中。
　　 α-珠蛋白稳定蛋白AHSP是新近发现的α-珠蛋白特异的分子伴侣。AHSP的结构决定其功能，通过结合并稳定各种形式的α-珠蛋白，AHSP可以减少ROS的产生，在正常的红系发生和地贫发生发展过程中发挥重要作用。以AHSP为靶标，寻找可以预防地贫发生，缓解或者改善地贫症状的药物是很有前景的地贫治疗方案。因此关于AHSP表达调节的研究显得尤为重要。
　　 AHSP是作为GATA-1的靶基因被发现的，GATA-1对AHSP的调节作用也是最早被详细阐明的。Gallagher等人通过5’RACE的方法首先鉴定了AHSP启动子区的5’端，进一步结合多种实验手段证明了GATA-1和广谱的转录因子Oct-1在AHSP调控区的结合位点，以人AHSP启动子导向的报告基因在转基因鼠体内特异地在骨髓、脾和网织红细胞等红系组织中表达。Pilon等人进一步在细胞和动物水平证明了EKLF对AHSP的转录激活作用，同时，EKLF作为染色质调节子还可以改变AHSP的染色质水平。另有文献报道表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂和细胞内的铁的水平都可以调节AHSP的表达。细胞内游离的铁可以通过与铁调节蛋白相互作用而去稳定AHSP的mRNA的稳定性，从而负调节AHSP在铁过多状态下的表达，加剧α-珠蛋白的不稳定性，进而加剧地贫的症状。机体内（尤其是病理状态下）是否存在其他正调节AHSP的因素，可以通过促进AHSP的表达而稳定游离的α-珠蛋白呢？我们在AHSP启动子区预测到小Maf家族成员的识别位点，因此推测CNC-bZIP家族成员NF-E2p45和Nrf2可能调节AHSP的表达。
　　 CNC-bZIP蛋白家族的成员众多，包括NF-E2，Nrf1，Nrf2，Nrf3，Bach1和Bach2等，均可以与小Maf家族蛋白形成二聚体。其中，NF-E2与GATA-1、EKLF等同为调节红系正常生成的重要转录因子，对红系分化晚期的珠蛋白基因的表达调节至关重要。而Nrf2主要在细胞氧化应激状态及抵抗炎症等方面发挥重要的调节作用，可以调节大量参与细胞保护的基因。
　　 我们首先检测了AHSP在14.5天胎鼠的不同组织中的表达情况以及在红系不同分化阶段的表达情况。我们以Hemin诱导的K562细胞模拟红系分化早期阶段，以DMSO诱导的MEL细胞模拟红系分化的晚期阶段。结果表明，AHSP在胚胎期的表达主要集中在红系发生的特异组织胎肝，并且在细胞系中AHSP与α-珠蛋白的表达均随着红系分化程度的增加而升高。在我们的实验体系里证明了AHSP作为红系特异蛋白的表达特点。
　　 我们进一步设计实验考察NF-E2p45和Nrf2对AHSP的调节作用。首先通过在MEL细胞亚型DS19细胞中干扰Mafk的方法检测其对AHSP的影响。在Mafk干扰的情况下AHSP的表达显著升高。提示我们Mafk的确可以调控AHSP的表达，但在细胞未被诱导情况下，Mafk募集转录抑制复合物，起抑制AHSP表达的作用。然后我们分别考察NF-E2p45和Nr 2对AHSP的调节作用。过表达和干扰NF-E2p45可以引起AHSP表达的上调和下调，说明NF-E2p45对AHSP存在正向调节作用；荧光素酶报告系统和ChIP证明NF-E2p45可以通过直接与AHSP调控区结合而在转录水平调节其表达。Nrf2与NF-E2p45得到相似的结论。以Nrf2特异性激活剂tBHQ和DEM处理K562细胞后，AHSP的表达显著上调；过表达和干扰Nrf2后AHSP相应地上调和下调；荧光素酶报告系统和ChIP进一步证明了Nrf2对AHSP的正向调节作用是发生在转录水平的。
　　 新的调节机制在怎样的细胞状态下发挥调控功能呢？我们通过在人慢性髓白血病K562细胞系中筛选过表达α-珠蛋白的稳定混合克隆株构建了模拟β-地中海贫血的细胞模型。首先通过WB的方法检测α-珠蛋白的表达情况，证明我们成功得到了过表达的稳定株。然后，细胞经DCFH-DA探针标记后通过流式细胞仪检测ROS的释放情况。由于α-珠蛋白更倾向以不稳定的单体形式存在，而β-珠蛋白可以自身形成相对稳定的二聚体或者四聚体，所以一般情况下游离的α-珠蛋白产生的ROS更多，β-地贫的症状也更严重。我们的分析结果也显示，过表达α-珠蛋白的细胞株比过表达β-珠蛋白以及过表达空载体的细胞株释放更多的ROS，与预期结果一致，说明我们构建的模型可以模拟β-地贫状态。文献报道表明Nrf2可以被ROS激活而调节下游靶基因的转录，因此我们进一步检测了细胞模型中Nrf2的激活情况和AHSP的表达情况。免疫荧光结果表明，过表达α-珠蛋白的K562稳定株和过表达β-珠蛋白的K562稳定株中的Nrf2都发生入核现象。同时检测的Nrf2的蛋白水平也显示，过表达α-珠蛋白的细胞株中Nrf2的表达水平与β-珠蛋白和空载体组相比最高。而在正常情况下胞浆中的Nrf2半衰期很短，与Keapl结合促使其很快经泛素-蛋白酶体途径降解。Nrf2入核及可经WB检测到蛋白水平都可以使我们得出结论，细胞模型中的Nrf2被过表达α-珠蛋白产生的ROS激活了。此时分析发现，地贫细胞模型中AHSP的表达在蛋白水平和RNA水平也都被上调了。为了证明AHSP的表达升高的确是由Nrf2引起的，我们进一步干扰了细胞模型中Nrf2的表达，Nrf2干扰造成地贫细胞模型中AHSP的表达不再上调，说明Nrf2是游离α-珠蛋白调节AHSP的关键蛋白。而此时检测NF-E2p45的表达并未发生改变，可以部分说明NF-E2p45在这个过程中没有发挥主要作用。结合已有的文献报道，我们的结果表明，在β-地贫状态下细胞内存在一个保护性的反馈环路：游离的α-珠蛋白通过释放ROS激活Nrf2信号通路，Nrf2引起AHSP的上调，AHSP表达升高后可以稳定游离的α-珠蛋白本身。
　　 虽然内在反馈环路的存在可以相对降低地贫的发生几率或者相对缓解地贫的症状，但是当机体已经出现严重地贫表型时，仅有内在的反馈环路是显然不够的，我们还需要利用外在手段通过给药等途径治疗地贫。Nrf2特异性激活剂tBHQ是一种强抗氧化剂，已有报道表明抗氧剂可以在细胞水平缓解红细胞的氧化状态，那么，tBHQ是否可以用于地贫的治疗呢？我们的结果表明tBHQ不仅在细胞水平，还可以在动物水平升高AHSP的表达，从而增强其对α-珠蛋白的稳定作用，并且在地贫细胞模型中tBHQ处理可引起AHSP的表达在内源性反馈增加的基础上进一步提高。提示了tBHQ作为潜在的治疗地贫药物的可能性。
　　 综上所述，我们的结果首次证明了NF-E2p45和Nrf2对AHSP的调节作用；第一次提出并证明了地贫状态下机体内存在内在的保护性反馈环路；并提示抗氧化剂tBHQ可以通过上调AHSP的表达而作为潜在的地贫治疗药物。

目录

前言

1.地中海贫血的相关研究

1.1 地中海贫血是人类最为常见的单基因遗传性疾病之一

1.2 地中海贫血主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两类

1.3 地中海贫血在分子水平的病理表现主要为ROS的产生

1.4 蛋白酶体途径和分子伴侣是红细胞对抗珠蛋白表达失衡的内源性机制

1.5 目前关于地中海贫血的治疗手段

2.α-珠蛋白稳定蛋白AHSP是红系相关的重要蛋白分子

2.1 AHSP是新近发现的GATA-1的重要靶基因之一

2.2 AHSP的结构是其发挥作用的分子基础

2.3 AHSP在正常红系发生及地中海贫血状态下均发挥重要功能

2.4 AHSP的表达受红系特异转录因子等多方面因素的调节

3.潜在的AHSP调节因子—CNC-bZIP家族转录因子

3.1 NF-E2的相关研究

3.2 Nrf2的相关研究

4.本研究的主要内容

材料与方法

1.实验材料

1.1 菌株与质粒

1.2 细胞系

1.3 实验用小鼠

1.4 限制性内切酶及修饰酶

1.5 抗体

1.6 其它主要试剂和材料

1.7 主要仪器设备

2.实验方法

2.1 基本技术路线

2.2 细菌操作与质粒的转化

2.3 细胞培养

2.4 细胞的转染和筛选

2.5 细胞的诱导

2.6 Nrf2特异性激活剂tBHQ和DEM处理细胞

2.7 半定量RT-PCR

2.8 Western blot分析蛋白水平的变化

2.9 双荧光素酶报告系统检测转录因子对AHSP启动子活性的影响

2.10 RNA干扰NF-E2p45和Nrf2检测对AHSP表达的影响

2.11 染色质免疫沉淀(ChIP)分析

2.12 α-珠蛋白过表达细胞系中ROS水平的检测

2.13 免疫荧光

2.14 小鼠胚胎组织的获取

2.15 tBHQ处理小鼠的骨髓细胞的获取

实验结果

1.AHSP表达的组织和分化阶段特异性

1.1 AHSP的表达具有组织特异性

1.2 AHSP的表达随红系分化程度的增加而升高

2.CNC-bZIP家族成员NF-E2 p45和NF-E2 related factor 2 (Nrf2)参与调节AHSP的表达

2.1干扰NF-E2 p18的表达影响AHSP的表达

2.2 NF-E2 p45可以正向调节AHSP的表达

2.3 Nrf2可以正向调节AHSP的表达

3.K562细胞中过表达的α-珠蛋白可以通过激活Nrf2调节AHSP的表达

3.1 构建α-珠蛋白和β-珠蛋白过表达载体

3.2 过表达的α-珠蛋白在非红系细胞中可以激活Nrf2的转录活性

3.3 过表达的α-珠蛋白在K562细胞中可以通过激活Nrf2上调AHSP的表达

4.Nrf2特异激活剂tBHQ在细胞和实验动物水平上调AHSP的表达

4.1 tBHQ可以进一步提高α-珠蛋白过表达的K562稳定株内AHSP的表达水平

4.2 tBHQ可以上调Balb/C小鼠体内AHSP的表达水平

讨论

1.地中海贫血与ROS的产生密切相关

1.1 珠蛋白合成不平衡导致地贫发生，游离的珠蛋白及其降解产物均可诱导ROS产生

1.2 ROS作为信号分子可以引发细胞内多种防御系统，Keap1-Nrf2最为关键

1.3 我们成功构建了可以模拟地贫状态的细胞模型，释放ROS

2.NF-E2p45和Nrf2是AHSP的两个新的调节蛋白

2.1 以AHSP为靶标治疗地贫，研究其调节很重要

2.2 NF-E2p45和Nrf2是潜在的AHSP调节蛋白

2.3 我们的研究发现NF-E2p45和Nrf2的确为AHSP的两个新的调节蛋白

2.4 与已报道的AHSP调节蛋白的比较

3.在β-地贫状态下存在一个内在的保护性反馈环路

3.1 β-地贫状态下的保护性反馈环路及其生理意义

3.2 NF-E2p45在反馈环路中可能不发挥作用

3.3 与其他ROS激活的细胞防御系统的比较

3.4 β-地贫状态下的其它内源性反馈调节机制

4.抗氧化剂与潜在的地贫治疗

4.1 已知可以缓解造血细胞氧化状态的抗氧化剂

4.2 tBHQ作为缓解地贫症状的抗氧化剂的优势

4.3 与其他Nrf2激活剂比较

5.本研究的不足之处和今后工作设想

小结

参考文献

附录1 文献综述

附录2 英文名词及缩写

致谢

个人简历

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