采用基于CDR3δ肽结合特性的免疫—生物化学技术策略鉴定TCRγδ所识别的新型配体——hMSH2蛋白

摘要

尽管人类外周血γδT细胞在整个T细胞群体中所占比例较少，但其在机体对抗感染和肿瘤的免疫应答中的重要作用却深受关注。然而，至今为止，γδT细胞所识别的抗原则很少被鉴定。不了解T细胞受体(TCR)γδ所识别配体，也就不可能深入了解γδT细胞的生物学功能。因此，进一步发现和鉴定TCRγδ所识别配体则成为γδT细胞研究领域亟待解决的突出问题。如何通过新的技术策略，来发现TCRγδ所识别新型配体是本研究着重考虑的科学问题，这也是进一步了解TCRγδ抗原识别特异性和多样性机制，揭示γδT细胞的生物学功能的关键问题。 TCR的抗原结合部位是由六个抗原决定簇(CDR)形成的，这六个CDR在识别抗原时作用是不相同的，其CDR3区在抗原识别时占有主导地位。鉴于TCR8 CDR3区(CDR38)与抗体重链的CDR3区在结构和功能上的相似性，因此，我们提出了CDR3δ的一级结构是决定TCRγδ识别抗原特异性的关键部位的学术假说。这一假说已为我们实验室前期工作所验证。我们根据卵巢上皮癌(OEC)组织浸润的γδT。细胞(γδTIL)TCR的一个CDR3δ的基因序列(OT3)，人工合成了OT3肽，并通过体外一系列OT3肽与靶细胞、靶组织或来源于靶细胞的蛋白的体外结合实验，验证OT3肽的结合特异性，所采用的方法包括OT3肽介导的生物传感器，免疫荧光技术，酶免疫技术和OT3肽竞争结合实验。同时，构建了用OT3序列替代抗体重链CDR3区序列的OT3移植抗体OT3Ab，也进行相应实验。本研究又重复了部分上述验证工作。结果显示，OT3肽和OT3Ab在对靶细胞、靶组织或来源靶细胞的蛋白的结合活性上享有相似的特异性。这就证明了CDR3δ确实在TCRγδ抗原识别特异性上起关键作用，也提示OT3肽能作为一个特异的探针，去筛选TCRγδ识别的抗原。 在上述验证工作的基础上，本研究共采用了三种技术策略去寻找TCRγδ识别的蛋白抗原：一是以OT3肽为探针在噬菌体随机展示十二肽库中筛选与OT3肽结合的十二肽，通过序列比对获得相应蛋白；二是以OT3肽为探针在人卵巢癌cDNAλ噬菌体表达文库筛选与OT3肽结合的克隆，通过测序鉴定蛋白；三是通过OT3肽偶联的亲和层析，从OEC肿瘤细胞系(SKOV3细胞)的总蛋白中分离与OT3肽特异性结合的蛋白，再利用质谱技术鉴定蛋白的种类。应用第一种技术策略，我们获得了三个OT3肽特异结合的十二肽。结合和功能验证实验结果显示，这些十二肽不但能特异性地结合TCRγδ，还能在体外促进γδT细胞活化，提示这些十二肽具有TCRγδ的表位肽活性。然而，在BLAST比对中未发现与这些多肽在序列上相匹配的人类相关蛋白，提示这些十二肽可能为来源于其它种属的表位肽。筛选人卵巢癌cDNAλ噬菌体表达文库要求探针具有较高的特异性和亲和力，在这两方面OT3肽不如一般的抗体，因此第二种策略也失败了。通过第三种策略，我们成功鉴定了三个TCRγδ识别的肿瘤相关抗原，它们是丙酮酸激酶3，人mutS同源蛋白2(hMSH2)和热休克蛋白(HSP)60。由于已有报道HSP60能被TCRγδ所识别，故鉴定出HSP60表明我们的策略是可行的。而丙酮酸激酶3以及与DNA损伤修复有关的hMSH2可能是TCRγδ识别的新的蛋白抗原。 本研究就hMSH2是否为TCRγδ配体这一问题进行了验证。RT-PCR结果显示，在卵巢癌细胞系SKOV3中，hMSH2 cDNA存在散在分布的点突变。SKOV3细胞培养上清中检测到分泌形式的hMSH2。用Western blotting在SKOV3细胞总蛋白中还发现一个60kD的hMSH2的缺失突变表达形式。而且，在包括SKOV3细胞在内的很多肿瘤细胞系细胞膜上均检测到hMSH2的表达。免疫组化结果证明，肿瘤组织中也有异位表达的hMSH2。另外，Vδ2 γδT细胞对SKOV3细胞的细胞毒活性也能被抗hMSH2抗体部分封闭。 同时，本研究还构建和表达了五种重组的hMSH2蛋白，包括hMSH2全长蛋白，分别含hMSH2 N端两个结构域和C端两个结构域的蛋白片段，以及SKOV3细胞表达的含有散在突变的两个分段蛋白。所有的这五个蛋白都能特异性与Vδ2γδT细胞结合，并刺激其活化增殖，分泌γ干扰素，并且促进Vδ2γδT细胞对靶细胞的杀伤活性。此外，本研究还利用昆虫病毒表达系统，得到了比原核大肠杆菌表达系统更具生物活性的hMSH2蛋白，这为hMSH2蛋白进一步结构与功能研究奠定了基础。 综上所述，本研究取得了以下学术成果： l、证明了CDR3δ在决定TCRγδ识别抗原特异性上的关键作用，TCRγδ识别抗原时仅仅依赖CDR3δ一级结构的特异性，因此人工合成的CDR3δ肽OT3是寻找TCRγδ抗原的很奏效的探针； 2、建立了一个采用基于CDR3δ肽结合特性的免疫.生物化学技术策略鉴定TCRγδ所识别的蛋白抗原的新的有效的方法； 3、首次发现在癌变的情况下，异位表达的hMSH2很可能是一个新的Vδ2γδT细胞所识别的肿瘤配体分子，其生物学意义在于对固有免疫系统的预警作用； 4、证明了昆虫病毒表达系统是一个稳定而有效的真核表达系统，在昆虫细胞中能完成很多翻译后的修饰，在使表达的外源蛋白保有天然蛋白的生物学活性上至关重要。 在上述的四点成果中，第二项和第三项最具有创新性。第二项成果解决了一项长期困扰免疫学界的难题，为鉴定TCRγδ所识别新型配体提供了一个有效的关键技术。第三项成果揭示γδT细胞免疫监视的新型作用方式，为全面阐明γδT细胞生物学功能提供了重要的线索，也为肿瘤的诊治提供了一个重要的靶标分子。

目录

论文说明：缩略词表

前 言

技术路线

第一部分：卵巢癌γδTILCDR3δ肽OT3肿瘤结合特异性验证及采用基于其结合特性的免疫-生物化学技术策略鉴定TCRγδ识别性蛋白抗原

实验材料

实验方法

实验结果

一、OT3肽与肿瘤细胞结合特异性验证

二、OT3Ab与肿瘤细胞结合特异性验证

三、筛选OT3肽反应性噬菌体随机展示十二肽

四、用OT3肽筛选预制人卵巢癌cDNAλ噬菌体表达文库

五、0T3肽偶联柱亲和层析钓取反应性蛋白

第二部分 hMSH2在肿瘤组织、细胞系中的表达情况分析及重组hMSH2蛋白及蛋白片段的原核表达和功能验证

实验材料

实验方法

实验结果

一、hMSH2在SKOV3中的表达

二、五个重组hMSH2蛋白的原核表达及功能验证

第三部分 hMSH2在昆虫病毒表达系统中的表达及与原核表达的hMSH2重组蛋白的生物活性比较

实验材料

实验方法

实验结果

一、hMSH2蛋白在昆虫病毒表达系统中的表达

二、昆虫病毒表达系统表达的hMSH2蛋白与原核大肠杆菌系统表达的hMSH2蛋白的生物活性对比

讨 论

全文小结

参考文献

文献综述 γδT细胞：受体和功能

个人简历

致 谢