双环醇对小鼠急性酒精性肝损伤和肝细胞凋亡的保护作用及机制研究

摘要

酒精性肝病(ALD)的发生、发展是涉及遗传、营养和环境因素的多因素过程，其早期发病机制与氧化应激、内毒素介导的细胞因子释放、线粒体损伤、肝细胞凋亡等密切相关。已知ALD的早期损伤如经及时治疗多可逆转，因此寻找治疗ALD的药物具有重要的临床意义。 本研究选用两种简单、易行的急性酒精性肝损伤模型，模拟ALD早期损伤，观察双环醇的保护作用，并针对ALD早期致病因素探讨双环醇的相关作用机制，为其临床应用提供科学可靠的实验依据。 1.双环醇对急性酒精中毒小鼠肝损伤的保护作用及机制研究。 小鼠单次酒精(6g/kg)灌胃可导致急性肝损伤，表现为血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平升高至对照组的2.3倍、肝脏甘油三酯蓄积达3.6倍以及中央静脉和小叶间静脉周围肝细胞肿胀、水样变性等病理变化。双环醇预处理(200，300mg/kg)剂量依赖性显著抑制血清ALT升高(分别降低60％和71％)和肝脏甘油三酯蓄积(分别降低18％和35％)，并明显改善上述肝组织病理变化。 氧化应激是急性酒精性肝损伤的主要诱因之一。酒精灌胃后6h时脂质过氧化产物硫代巴比妥酸反应性底物(TBARS)水平开始升高，12h时为对照组的2.7倍；而非酶抗氧化物谷胱甘肽(GSH)含量从1.5h即开始下降，6h时降至对照组的40％。双环醇(300mg/kg)可显著抑制TBARS水平的升高(32％)，并防止GSH耗竭，使其维持在正常水平。此外，酒精灌胃后1.5h时肝脏抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性发生显著变化，与对照组相比分别降低35％、18％、49％、45％。双环醇预处理(200，300mg/kg)可显著抑制SOD和GSH-Px活性的降低，使SOD活性分别恢复至对照组的94％和99％，GSH-Px活性分别恢复至对照组1.3倍和1.5倍。双环醇(300mg/kg)对CAT和GR活性的降低也有一定改善作用，但无统计学意义。 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素—1β(IL-1β)是介入ALD损伤的重要炎症因子。酒精灌胃后1.5h肝脏TNF-α和IL-1β蛋白水平开始升高，12h达峰，分别为正常对照组的2.4倍和1.7倍。双环醇(200，300mg/kg)可明显抑制肝脏TNF-α和IL-1β水平升高，使TNF-α蛋白水平分别降低33％和47％，IL-1β蛋白水平分别降低26％和46％。酒精灌胃后12h，TNF-α和IL-1βmRNA表达分别增至对照组的2倍、2.4倍，而双环醇可明显抑制这一变化。此外，双环醇(300mg/kg)还可减少Kupffer细胞TNF-α的表达。 内毒素是激活Kupffer细胞的主要因素。酒精灌胃后1.5h血浆内毒素含量显著升高(达到对照组的9.6倍)，6h后可恢复至正常水平。双环醇(200，300mg/kg)可显著抑制血浆内毒素含量升高，抑制率分别为79％、60％。CD14是内毒素活化Kupffer细胞的关键受体。酒精灌胃后12h可诱导Kupffer细胞CD14的高表达。双环醇(300mg/kg)可显著抑制CD14的过表达。 由此可见，双环醇对急性酒精性肝损伤有显著的保护作用，其肝保护机制可能与减轻氧化应激、抑制细胞因子表达、降低血浆内毒素水平和CD14表达以抑制Kupffer细胞活化相关。 2.双环醇对酒精中毒小鼠肝脏细胞凋亡的保护作用及机制研究。 小鼠连续三次酒精(6g/kg)灌胃后可导致明显肝损伤，变现为血清ALT水平升高(为对照组的2.2倍)，肝脏炎症相关蛋白环氧合酶—2(COX—2)表达增加(为对照组的2.2倍)，肝组织出现髓样变性、小空泡变性和炎性细胞浸润。酒精中毒小鼠还出现明显的肝细胞凋亡，表现为脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色阳性细胞数显著增加。双环醇给药可明显降低酒精诱导的血清酶学改变，还可抑制COX—2蛋白的过表达，减轻肝脏病理改变，同时具有抑制肝细胞凋亡的保护作用。 酒精在体内的代谢过程中可生成毒性代谢产物—乙醛，同时伴随产生大量活性氧自由基(ROS)，是后续氧化/硝化应激的始发因素。模型组参与乙醇代谢的胞浆乙醇脱氢酶(ADH)活性升高至对照组的1.5倍，微粒体细胞色素P4502E1(CYP2E1)活性和蛋白表达也分别升高至对照组的2.2倍和2.6倍。双环醇(300mg/kg)可使ADH和CYP2E1活性分别降低20％和25％，CYP2E1蛋白的过表达可基本恢复至正常水平。此外，模型组线粒体和胞浆乙醛脱氢酶(ALDH)活性分别升高27％和66％，双环醇(300mg/kg)可显著抑制胞浆ALDH活性的增加。 酒精引起的氧化应激可导致模型组动物肝脏氧化蛋白含量升高至对照组的1.7倍，胞浆NAD+/NADH则降低30％，而线粒体GSH含量降低10％。双环醇给药(200，300mg/kg)可显著抑制酒精诱导的氧化蛋白含量升高，改善NAD+/NADH下降，并使GSH维持在正常水平。 除氧化应激外，酒精还可诱发硝化应激。酒精连续三次灌胃后，小鼠肝脏一氧化氮(NO)含量升高至对照组的1.5倍，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和蛋白表达分别升高至对照组的2.6和3.2倍，硝基酪氨酸(NT)蛋白表达升高至对照组的2.5倍。双环醇200，300mg/kg给药可显著降低酒精引发的NO含量升高，使之接近正常水平，300mg/kg明显抑制iNOS和NT蛋白的过表达(40％和53％)。 ALD中氧化/硝化应激可引发线粒体损伤，启动内源性凋亡信号通路。模型组小鼠肝脏线粒体对罗丹明123(R123)的摄取量明显少于对照组，对高钙浓度诱发肿胀的敏感性降低(50％)，提示线粒体发生了膜渗透性转换。双环醇(200，300mg/kg)可显著改善受损的线粒体功能，表现为线粒体对R123的摄取量以及高钙浓度引发的吸光度下降幅度均明显增加。此外，模型组线粒体呼吸链功能受到明显抑制，线粒体呼吸链复合物(MRC)Ⅰ和MRCⅣ活性分别下降为正常对照组的42％和70％。双环醇300mg/kg给药后MRCⅠ和MRCⅣ活性较模型组均有明显升高，分别恢复至对照组的65％和85％。线粒体损伤最终导致细胞色素C释放入胞浆，表现为模型组肝脏胞浆细胞色素C蛋白含量增加至正常对照组的2倍。双环醇给药组胞浆细胞色素C蛋白含量几乎接近正常水平。Bax和Bcl—XS/L分别为重要的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，模型组两种蛋白表达均上调，分别达到对照组的1.6倍和3.1倍。双环醇300mg/kg对Bax和Bcl—XS/L的过表达均有一定抑制作用。 Fas/Fas配体(FasL)参与死亡受体介导的外源性凋亡通路。模型组肝脏Fas、膜结合型FasL(mFasL)、可溶性FasL(sFasL)蛋白表达分为上调为对照组的1.5倍、4和2倍。双环醇300mg/kg可使Fas表达降低为模型组的45％，mFasL和sFasL的表达恢复正常水平。模型组肝脏细胞核中核因子—κB(NF—κB)的蛋白表达也有明显变化，即降至对照组的16％，此外胞浆抑制蛋白—κB(ⅠκB)的蛋白表达较对照组增加15％。双环醇300mg/kg可使NF—κB蛋白表达维持在正常水平，同时抑制ⅠκB的过表达(50％)。 由此可见，双环醇对酒精所致肝细胞凋亡有明显的保护作用，其机制与影响酒精代谢酶活性和/或表达、抑制氧化/硝化应激，改善线粒体损伤，减轻Fas/FasL过表达，从而同时抑制内源性、外源性凋亡信号通路有关。 综上所述，双环醇对酒精引起的小鼠肝脏损伤具有明显的保护作用。其不仅可抑制血清转氨酶升高、肝脏甘油三酯蓄积，还可改善肝细胞肿胀、水样和髓样变性、炎性细胞浸润等病理学损伤。此外，双环醇对肝细胞凋亡也有显著的抑制作用，其保护作用的机制可归纳为： 1)酒精代谢酶调控：抑制ADH和ALDH活性，抑制CYP2E1活性并下调蛋白表达。 2)抑制氧化应激：减轻脂质过氧化，恢复GSH含量，改善抗氧化物酶SOD、GSH-Px、GR、CAT的活性，减少氧化蛋白含量，恢复NAD+/NADH 3)抑制硝化应激：降低NO水平，抑制iNOS和NT蛋白过表达 4)调节炎症细胞因子表达：下调TNF-α、IL-1β蛋白和mRNA表达 5)抑制Kupffer细胞活化：降低内毒素水平，抑制CD—14过表达 6)减轻线粒体损伤：维持线粒体膜完整性和正常膜电位，恢复线粒体GSH含量，增加MRCⅠ和Ⅳ活性，减少细胞色素C释放 7)调节凋亡相关蛋白：下调Fas、mFasL、sFasL、Bax、Bcl—XS/L、Ⅰ—κB蛋白表达，上调NF—κB蛋白表达 上述研究为进一步了解双环醇的肝保护作用特点以及临床治疗ALD提供了有参考价值的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表　Abbreviation

声明

引言

第一部分双环醇对急性酒精中毒小鼠肝损伤的保护作用及机制研究

前言

材料和方法

实验结果

1.双环醇对急性酒精中毒小鼠肝脏损伤的保护作用

2.双环醇对急性酒精中毒小鼠肝脏氧化损伤的保护作用

3.双环醇对急性酒精中毒小鼠肝脏炎症因子表达的影响

4双环醇对急性酒精中毒小鼠血浆内毒素升高的保护作用

5双环醇对急性酒精中毒小鼠肝脏CD-14表达的影响

讨论

小结

参考文献

第二部分双环醇对酒精中毒小鼠肝脏细胞凋亡的保护作用及机制研究

前言

材料和方法

实验结果

1.双环醇对酒精中毒小鼠肝损伤的保护作用

2.双环醇对酒精中毒小鼠肝脏细胞凋亡的保护作用

3.双环醇对酒精中毒小鼠肝脏酒精代谢相关酶的影响

4.双环醇对酒精中毒小鼠肝脏氧化应激的保护作用

5.双环醇对酒精中毒小鼠肝脏硝化应激的保护作用

6.双环醇对酒精中毒小鼠内源性凋亡通路的影响

7双环醇对酒精中毒小鼠外源性凋亡通路的影响

讨论

小结

参考文献

综述酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展

致谢

附录博士研究期间发表文章和参加会议