遗传性扩张型心肌病LMNA基因突变的致病机理研究

摘要

核纤层蛋白基因突变可以引起扩张型心肌病，其特点是以房室传导阻滞为首发症状，心脏扩张症状出现迟于电生理异常；患者猝死率高，死因常为恶性心律失常。其发病机制现在尚不清楚，本研究从分子电生理机制方面探讨传导阻滞首发的原因，为疾病表型的发生机理提供一个可能的假说。
　　 第一部分遗传性扩张型心肌病LMNA基因突变体表达载体的构建
　　 目的：构建遗传性扩张型心肌病LMNA基因E82K、R644C、N195K突变体表达载体。方法：利用快速PCR定点突变技术，设计一对引物（包含预定的突变），通过PCR扩增出含突变位点的质粒，然后转化到超级感受态细胞中，用碱裂解法抽提质粒，进行测序鉴定，得到构建遗传性扩张型心肌病LMNA E82K、R644C、N195K突变体HEK293细胞异源表达载体：通过测序验证突变的正确性。结果：测序验证我们成功构建了遗传性扩张型心肌病LMNA基因E82K、R644C、N195K突变体表达载体。结论：成功构建表达载体为下一步研究奠定基础。
　　 第二部分致遗传性扩张型心肌病房室伴传导阻滞的核纤层蛋白基因突变下调钠电流密度
　　 目的：传导阻滞和恶性心律失常常与钠通道障碍有关。因此，本部分研究核纤层蛋白基因突变对钠通道功能的影响。方法：采用聚合酶链反应法制备相关LMNA突变体：E82K、R644C和N195K。将突变和野生的LMNA突变体和SCN5A的cDNA共转到HEK293细胞，应用全细胞膜片钳技术记录通道电流；利用实时定量RT-PCR和Western blot分析SCN5A基因表达水平。结果：相比于野生型，LMNA E82K明显降低HEK293细胞钠电流密度LMNA（86.19±9.36pA/pF，n=30 vs.155.73±19.09pA/pF，n=47：p=0.001），而LMNA R644C和N195K对此无明显影响。LMNA突变体不影响SCN5A的转录水平，但是LMNA E82K会抑制SCN5A蛋白表达，幅度达到30％。其他两个突变对蛋白表达水平并无影响。结论：核纤层蛋白导致的钠电流密度减小可能是核纤层蛋白突变致心脏传导阻滞的机制之一，它通过抑制蛋白表达水平抑制电流，而不影响转录水平；但它并非是唯一机制，LMNA N195K可能通过其它机制引起临床上传导阻滞的疾病表型。
　　 第三部分致遗传性扩张型心肌病伴房室传导阻滞的核纤层蛋白基因突变引起缝隙连接43重构
　　 目的：核纤层蛋白基因突变引起的扩张型心肌病的特点是以房室传导阻滞为首发症状，心脏扩张症状出现较迟。这种疾病表型与缝隙链接蛋白异常引起的心脏疾病相似。本部分研究核纤层蛋白基因突变对缝隙链接蛋白的影响。方法：利用野生和突变（E82K和R644C）的核纤层蛋白基因转染乳鼠心肌细胞，通过共聚焦显微镜和蛋白印迹分析探索缝隙链接改变。结果：E82K突变使缝隙链接蛋白43的表达量减少40％，其定位也发生改变，由细胞连接处转移到细胞内；但该突变对缝隙链接蛋白40影响不显著。而R644C突变对缝隙链接蛋白43和40都无明显影响。结论：核纤层蛋白基因突变导致的缝隙链接蛋白表达和定位的改变可能是导致心脏传导阻滞表现的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一部分 遗传性扩张型心肌病LMNA基因突变体表达载体的构建

前言

材料与方法

实验结果

结论

参考文献

第二部分 致遗传扩张型心肌病房室伴传导阻滞的核纤层蛋白基因突变下调钠电流密度

前言

1 材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 致遗传性扩张型心肌病伴房室传导阻滞的核纤层蛋白基因突变引起缝隙连接43重构

前言

方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

综述1 核纤层蛋白基因与扩张型心肌病

参考文献

附表、附图

综述2 SCN5A基因与扩张型心肌病

参考文献

个人简历

致 谢