HSV-IUS1基因缺失重组病毒和UL35荧光标记重组病毒的构建

摘要

疱疹病毒具有较高的人群感染率,尤以Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus typeⅠ,HSVI)的感染最为常见,由于该病毒具有潜伏感染的特性,所以当感染HSVI病毒后,虽然能引起机体产生免疫应答,但并不能将病毒彻底清除,病毒在宿主的三叉神经节细胞或周围星形神经胶质细胞中潜伏,在某些因素的影响下,病毒可再次激活而增殖,引发角膜炎、脑炎等多种症状。
　　 Ⅰ型单纯疱疹病毒的基因表达具有严格的时序性,按其表达先后顺序可以将病毒的基因分为立即早期基因(α)、早期基因(β)和晚期基因(γ)3类,前一期的基因表达为后一期基因表达所必需。
　　 本课题前期工作对α基因编码的5种立即早期蛋白之一的ICP22和γ基因编码的7种核衣壳蛋白之一的VP26进行了研究。对ICP22的研究发现,该蛋白不但对病毒的早期基因和晚期基因有调节作用,而且对自身基因和细胞基因有转录抑制的效果,同时还发现VP16与其相互作用能解除这种抑制作用,这样的研究结果有助对病毒级联反应和潜伏感染的特性做深入的解释；对VP26的研究发现,该蛋白和病毒的出细胞膜有着直接的关系,并通过酵母双杂交系统筛查到VP26和细胞膜上的蛋白CMTP-7有相互作用,推测VP26蛋白通过和CMTP-7的相互作用,触发了HSVI包膜化的进程,并且在完成HSVI的包膜化的同时进行有效出胞过程。这些研究虽然给我们认识HSVI提供了一些新的线索和思路,但前期工作只是建立在基因水平上的研究,无法确定目的蛋白在病毒中的作用以及与其相互作用的其它蛋白及相互作用。因此,进一步研究在病毒水平上ICP22蛋白的作用,ICP22蛋白的缺失对病毒的感染复制是否有较大的影响,VP26蛋白是否与病毒的出入胞膜过程有很大的关系,同时也为了能定位VP26蛋白在不同时期细胞内外的表达情况。只有通过构建重组病毒的手段,在病毒水平上对以上两个蛋白进行研究。
　　 本实验根据研究目的不同利用同源重组的方法构建了ICP22缺失和VP26示踪的重组病毒,为了研究ICP22蛋白缺失是否影响病毒的感染复制以及ICP22蛋白在病毒水平上功能,利用同源重组方法用绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因取代ICP22蛋白的编码基因。利用流式细胞仪分选结合蚀斑筛选的方法得到ICP22蛋白缺失的单克隆重组病毒,利用蚀斑直接筛选得到用GFP示踪VP26蛋白的单克隆重组病毒。对ICP22蛋白缺失重组病毒进行绿色荧光的表达情况的镜下观察、GFP基因序列的测定、重组病毒中GFP基因的定量PCR检测、GFP蛋白表达的Western blot检测等方法进行了验证,成功构建了ICP22蛋白缺失的重组病毒,并在研究过程中发现ICP22蛋白缺失的重组病毒出现感染复制停滞的现象,在充分说明ICP22蛋白在细胞中具有重要的功能的同时也提示,能否利用重组病毒的嗜神经特性和病毒复制感染的停滞性,提供一种安全的递送外源基因的病毒载体,用于治疗神经系统的疾病。
　　 为了验证VP26蛋白在病毒水平与出细胞膜之间的关系,将绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因插入VP26蛋白编码基因的起始密码子后,利用荧光的表达可以检测VP26蛋白在病毒感染进程中不同时段在细胞内的定位。显微镜下观察VP26蛋白示踪的重组病毒荧光表达情况、GFP基因序列的测定等方法进行了验证,成功构建了VP26蛋白示踪的重组病毒,可以利用绿色荧光的表达时时观测VP26蛋白在细胞中的定位以及研究该蛋白与病毒出入胞膜之间的关系,
　　 综上所述,重组病毒有助于在病毒水平研究目的蛋白的相关功能,ICP22蛋白缺失的重组病毒和VP26蛋白示踪重组病毒的成功构建,对于在病毒水平研究这两个蛋白的功能有重要意义。