血小板生成素及T、B淋巴细胞功能异常在免疫性血小板减少症发病机制中的作用

摘要

目的：
　　 评价成人ITP患者TPO水平与激素治疗及预后的关系，T、B淋巴细胞功能异常与病情活动的相关性。
　　 方法：
　　 1、收集2008年7月至2009年7月就诊于北京协和医院的血小板减少症患者的临床资料及外周血标本；
　　 2、酶联免疫分析法（EIISA）测定原发性ITP组（PITP）、系统性红斑狼疮相关ITP组（SLE-ITP）、正常对照组3个实验组的人血浆血小板生成素（TPO）水平并进行比较；
　　 3、流式微球分析（CBA）法测定血浆中Th1/Th2/Th17细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A）水平；
　　 4、改良间接MAIPA法测定血浆中抗血小板GPI和GPIIb特异性抗体；
　　 5、B细胞酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）测定外周血单个核细胞中抗GPIIb/IIIa特异性效应B细胞和记忆B细胞的频数；
　　 6、CBA法测定单个核细胞培养上清的Th1/Th2/Th17细胞因子水平。
　　 结果：
　　 1、就诊的血小板减少症患者共252例，其中PITP132例，继发性ITP54例。PITP共132例中男性51例、女性81例，中位发病年龄为38岁，有出血表现者为77例，发病时的血小板计数的中位值为25×109/L，骨髓巨核细胞计数中位值为186个/片。抗核抗体（ANA）阳性者33例（25％），LA阳性4例，β2GPl阳性者3例。2010-4电话随访88例，其中激素治疗可获得完全缓解者53例（60％），部分有效者21例（24％），无效者14例（16％）。ANA阳性组激素治疗后复发及治疗无效的比例均显著高于ANA阴性组（P<0.05）。
　　 2、血浆TPO水平，PITP组（256.20±846.20pg/ml）和SLE-ITP组（195.69±383.15pg/ml）TPO值均高于正常对照组（22.83±32.46 pg/m1），有显著性差异（P<0.01），TPO水平与血小板计数呈负相关（r=-0.488，P值<0.01），与骨髓巨核细胞计数无明确相关性（r=-0.160，P值=0.116）。激素治疗持续CR（CCR）组12例中1例TPO增高，复发组则有25％（8/32）TPO水平增高，而激素无反应组则有33.3％（4/12）TPO水平增高。三组间TPO值及TPO增高者比例均无显著差异。
　　 3、PITP组与正常对照组相比，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF，IFN-γ和IL-17A水平均无显著性差异。SLE-ITP组与PITP组比较，SLE-ITP组IL-10水平显著高于PITP组，血小板计数和IL-2、IL-4、IL-6、TNF、INF-γ和IL-17A水平与PITP组相比均无显著差异。血小板计数与IL-17A（r=0.149，P=0.038）和IFN-γ（r=0.142，P=0.046）呈正相关，但相关性不强； IL-17A与IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ均显著正相关（r=0.647，0.892，0.879，0.644，0.253，0.921，P<0.01）。
　　 4、93例PITP和26例SLE-ITP患者进行改良MAIPA检测。PITP组MAIPA-GpI阳性率为22.6％，MAIPA-GpIIb为23.7％，SLE-ITP组MAIPA-GpI为46.2％，MAIPA-GplIb57.7％，PITP缓解组8例中仅有MAIPA-GplIb1例阳性。PITP组MAIPA总阳性率高于PITP缓解组而低于SLE-ITP组，p<0.01。MAIPA阳性组患者IL-6浓度与IL-10浓度显著高于阴性组。
　　 5、ELISPOT法测定抗GpIIb/IIIa特异性效应B细胞频数，在PITP组（n=70）、SLE-ITP组（n=16）和激素治疗CR组（n=10）分别为8.18±27.22/106PBMC，7.90±20.81/106PBMC，和3.50±4.47/106PBMC，三组之间无显著性差异：正常对照组（N=10）的频数为1±1.13/106PBMC，显著低于PITP组（P=0.03）。加入含PWM+SAC B细胞刺激培养组产生IgG的B细胞数为288.26±355.43/105PBMC，未刺激组为28.534±54.82/105PBMC。PWM+SAC刺激组产生总Ig的B细胞数显著高于未刺激组。PITP活动组组特异性GPIIb-IIIa记忆B细胞实际频数（27.35±30.13％）显著高于SLE-ITP（11.49±16.19％）（P<0.01），与激素治疗CR组（28.47±29.60％）无显著差异。
　　 6、CBA法共测定34例患者单个核细胞培养上清Th1/Th2/Th17细胞因子，PWM+SAC刺激组IL-4、IL-6、IL10、TNF、IL-17A值均显著高于未刺激组。PWM+SAC刺激组IL-4、IL-6、IL10、TNF、IL-17A浓度与总记忆B细胞频数呈显著正相关（P<0.01），IL-4、IL-6、IL10浓度与特异性记忆B细胞频数呈显著正相关（P<0.05）。
　　 结论：
　　 1、血小板减少症以原发性ITP最多见，继发性ITP的病因多为自身免疫性疾病（尤其SLE）。部分原发性ITP患者可有ANA阳性，ANA阳性者激素疗效较差。
　　 2、成人慢性原发性ITP患者的TPO水平较正常组显著升高，血小板数目越低者TPO水平越高，激素无效者较激素CCR者TPO水平较高但差异不显著，TPO水平与巨核细胞增生程度之间的关系暂不明确。
　　 3、成人慢性原发性ITP患者的Th1、Th2细胞因子分泌水平与正常对照相比并无显著差异，Th2细胞在血小板特异性抗体产生中可能起着重要的作用，Th17细胞可能在抗GPI抗体产生中起到了一定作用。
　　 4、PITP与SLE-ITP组患者外周血单个核细胞中特异性GPIIb-IIIa效应B细胞的频数均明显高于正常对照，Elispot方法检测特异性GPIIb-IIIa效应B细胞不受ITP患者是否进行激素治疗的影响，不论其是否缓解均可进行检测，但无法区分PITP和SLE-ITP。
　　 5、Th2细胞在ITP记忆B细胞体外培养活化中有关键作用，激素治疗并不能清除PITP患者外周血中的记忆B细胞。
　　 6、PITP组特异性GPIIb-IIIa记忆B细胞实际频数显著高于SLE-ITP，特异性记忆B细胞实际频数可能有助于PITP和SLE-ITP的鉴别。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语表

第一部分 免疫性血小板减少症的临床特点和血小板生成素在其中的作用

引言

一、研究目的

二、材料和方法

1、研究对象

2、研究方法

三、结果

1、血小板减少症的病因分析

2、免疫性血小板减少症患者初诊时临床资料分析

3、ANA与激素治疗疗效关系

4、TPO在免疫性血小板减少症发病中的作用及与疗效的相关性分析

四、讨论

1、免疫性血小板减少症的病因和临床表现的相关性

2、TPO在ITP发病中的作用

五、结论

第二部分 ITP患者血小板抗体与T、B细胞相关功能的研究

引言

一、研究目的

二、材料和方法

1、实验对象及分组

2、主要实验试剂

3、主要实验仪器及耗材

4、实验步骤

5、实验数据分析

三、结果

1、CBA检测结果

2、PITP、SLE-ITP组的MAIPA检测结果

3、细胞因子水平与其他因素的相关性分析

4、PITP组、SLE组、PITP缓解组效应B细胞ELISPOT测定结果

5、PWM+SAC B细胞刺激培养组（记忆组）与未刺激组（效应组）产率对比

6、PITP组、SLE组、PITP缓解组记忆B细胞ELISPOT结果对比

7、培养上清Th1/Th2/Th17细胞因子测定

8、记忆B细胞频数与相关因素的相关性分析

四、讨论

1、PITP与Th1/Th2平衡

2、Th17细胞在ITP发病中的作用

3、外周血特异性效应B细胞和记忆B细胞的转化和抗体分泌在PITP发病中的作用

五、结论

参考文献

综述

参考文献

附录：一例Fechtner综合征异常家系临床与分子缺陷研究（附文献复习）

参考文献

致谢

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