亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究

摘要

硒是具有抗癌作用的人体必需微量元素之一，大量证据表明，超营养剂量的硒能够诱导前列腺癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡。在本实验室的前期工作中已经发现，20μM亚硒酸钠（sodiuin selenite）能够诱导人急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）细胞株NB4发生显著凋亡，活性氧（active oxygen species，ROS）是关键的上游调控因素。亚硒酸钠刺激NB4细胞迅速产生大量活性氧，通过活性氧启动线粒体凋亡通路与内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）凋亡通路。为了详细阐明NB4细胞在亚硒酸钠诱导凋亡的过程中发生的分子生物学变化，我们仍然需要进行更深入的探索。
　　 本研究在前期工作的基础上，进一步探讨了在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中，一些受到活性氧调节的重要分子的变化情况、调节通路及其对凋亡的意义，重点对关键抗氧化酶MnSOD（manganese superoxide dismutase）进行了研究。经Westernbolt发现，亚硒酸钠在诱导NB4细胞凋亡的同时引起了MnSOD的显著上调，活性氧清除剂MnTMPyP完全阻断该上调效应，提示活性氧是其上游调控因素。经不同活性氧探针检测发现，亚硒酸钠作用后诱导两种细胞内活性氧超氧自由基（superoxide radical）与过氧化氢（hydrogen peroxide）迅速而显著的升高，其中超氧自由基可能对于MnSOD的上调起主要作用。就具体通路而言，蛋白激酶ERK（extracellular signal-regulated kinase）与转录因子p53是活性氧介导MnSOD上调的关键因素。cDNA测序结果证明本研究使用的NB4细胞表达野生型的p53。经Western blot检测核蛋白提取物和免疫荧光染色发现，亚硒酸钠诱导细胞产生活性氧后，活性氧促使ERK2从胞质转位至核内，磷酸化p53的关键位点Serl5。免疫共沉淀结果显示，ERK2在核内通过直接作用的方式磷酸化p53。采用该方法还发现，在未经亚硒酸钠作用的NB4细胞的核内，p53与其抑制性蛋白MDM2（mouse doubleminute2）处于结合状态，而经亚硒酸钠处理后，核内p53被ERK磷酸化，从而与MDM2解离而被激活。采取p53选择性抑制剂Pifithrin-α（PFT）抑制其转录活性，或通过siRNA干扰降低其表达，均能显著抑制亚硒酸钠诱导的MnSOD上调，提示p53作为MnSOD的上游转录因子诱导了其表达。对于p53缺失或突变的白血病细胞株HL-60或L937，亚硒酸钠不能诱导MnSOD上调，进一步证明了p53的重要作用。通过上述研究阐明了亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中，细胞内存在一条ROS-ERK-p53-MnSOD信号通路，该通路可能是NB4细胞在面临氧化应激时启动的重要抗氧化机制。
　　 前期研究已经发现，在未经亚硒酸钠处理的NB4细胞中存在活跃的自噬作用，亚硒酸钠处理后，在诱导凋亡的同时伴有自噬的减弱。本研究在此基础上进行了进一步探讨，发现p53的激活除了诱导MnSOD上调，还是亚硒酸钠促进NB4细胞由自噬转向凋亡的关键因素。Western blot和免疫共沉淀结果显示，亚硒酸钠通过蛋白激酶ERK和p38MAPK引起p53关键位点Ser15的磷酸化，进而导致p53与其抑制性蛋白MDM2解离并被激活。借助免疫荧光染色与免疫共沉淀发现，在此过程中核仁蛋白B23从核仁转位至核质，与MDM2共定位并发生相互作用，从而起到稳定p53的作用。采用p53抑制剂PFT抑制其活性或通过siRNA干扰降低其表达，均能显著逆转亚硒酸钠诱导的凋亡、caspases激活以及自噬标志分子Beclin-1和LC-3的表达下调，表明激活后的p53一方面促进凋亡的进行，另一方面抑制自噬，从而在NB4细胞由自噬转向凋亡的过程中扮演关键角色。
　　 本研究还发现，在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡后期，蛋白激酶PKCalpha（proteinkinase Calpha）在蛋白水平与磷酸化水平均显著下调，其下调同样由活性氧所介导。采用PKCalpha抑制剂与siRNA干扰发现，PKCalpha在NB4细胞中发挥抗凋亡作用，并且该作用建立在其对蛋白激酶ERK与Akt调节的基础之上，活性氧探针检测发现，PKCalpha还具有抑制活性氧产生的作用。此外，活性氧还激活了蛋白水解酶caspase-3，诱导磷酸酶PP2Ac的表达，在凋亡后期，活性氧通过caspase-3与PP2Ac分别在蛋白水平与磷酸化水平下调PKCalpha，从而加速了凋亡的进行。因此，下调抗凋亡激酶PKCalpha可能是亚硒酸钠在凋亡后期维持并促进凋亡的重要机制之一。
　　 细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ（cytochrome c oxidase subunitⅣ，COXⅣ）是线粒体呼吸链的重要组分，在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡后期，该蛋白同样受到活性氧的显著下调，RT-PCR显示其mRNA水平没有明显变化，提示非转录机制参与其下调。进一步研究发现，活性氧通过激活caspase-3介导COXⅣ的下调。采用shRNA表达载体抑制COXⅣ的表达，能够显著增强亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡，表明亚硒酸钠可能通过ROS-caspase-3-COXⅣ这一途径损伤线粒体呼吸链，加速凋亡的进行。

目录

文摘

英文文摘

前 言

材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果与讨论

第一部分

第二部分

第三部分

第四部分

全文小结

参考文献

文献综述

参考文献

缩略词表

致 谢

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