端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生

摘要

第一部分：端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生
　　 目的：建立包括Q-FISH、Flow-FISH、Southern Blot和RT-PCR等多种检测细胞端粒长度的技术平台；并选择其中一种方法检测767例原发性高血压人群和正常对照人群5年前后外周血单个核细胞端粒长度，试图明确端粒长度与原发性高血压之间的关系。
　　 方法：制备mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血单个核细胞悬液，用端粒特异的FITC-PNA探针标记后激光共聚焦显微镜观察荧光数目及强度；制备mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血单个核细胞悬液，用端粒特异的FITC-PNA探针标记后流式细胞仪分析并计算细胞荧光强度；提取mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血单个核细胞基因组DNA，以293T细胞基因组DNA为标准品，通过RT-PCR方法测定细胞端粒相对长度；提取人外周血单个核细胞基因组DNA，HinfⅠ和RsaⅠ酶切后经Southern Blot方法测定细胞端粒绝对长度；提取900例人外周血单个核细胞基因组DNA，通过RT-PCR方法测定细胞端粒相对长度。
　　 结果：Flow-FISH方法测得mTerc-/-小鼠外周血单个核细胞端粒相对长度为0.5345，RT-PCR方法测得mTerc-/-小鼠外周血单个核细胞端粒相对长度为0.5717，其结果基本一致；SouthemBlot方法测得10例人外周血单个核细胞端粒绝对长度与RT-PCR方法所测端粒相对长度结果基本一致，经统计学分析具有高度相关性(P＜0.01)：RT-PCR方法测得767例人外周血单个核细胞端粒相对长度，统计学分析表明原发性高血压组平均端粒长度（中位数=0.57，IQR=0.48to0.72）较正常对照组(中位数=0.67，IQR=0.53to0.93)短，两者有显著性差异(P＜0.001)；所有研究对象端粒长度随年龄增加而下降，但原发性高血压组端粒长度下降速率较快(P=0.038)；所有研究对象中在5年内发生冠脉疾病者平均端粒长度与未发病者相比较短(P＜0.001)，原发性高血压组在5年内发生冠脉疾病者平均端粒长度与未发病者相比较短(P=0.031)：正常对照组在5年内发生冠脉疾病者平均端粒长度与未发病者相比较短(P＜0.001)。
　　 结论：成功建立了检测细胞端粒长度的Q-FISH、Flow-FISH、Southern Blot和RT-PCR技术平台，其结果稳定可靠，具有高度相关性，适用于不同样本来源的细胞端粒长度的检测。对767例原发性高血压人群和正常对照人群5年前后外周血单个核细胞端粒长度的检测结果提示，人外周血单个核细胞的端粒缩短不但是原发性高血压发病的重要危险因素，而且还影响了高血压并发症的发生：端粒缩短可以作为生物衰老和发生衰老相关疾病的生物学标记之一。该部分实验首次验证了端粒缩短与高血压预后的因果关系。
　　 第二部分：shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统内的长期稳定表达
　　 目的：构建可高效感染小鼠造血干细胞的shRNA重组慢病毒载体，并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。
　　 方法：用SFFV启动子更换p-CMV慢病毒载体中的CMV启动子，将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后，采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞，获得具有感染能力的成熟慢病毒；经超速离心获得高滴度的病毒悬液，体外感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞；流式分析其表达效率后，选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞，并通过竞争性骨髓移植技术输入放射线照射后的免疫抑制小鼠体内；在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本，移植后16周获取小鼠骨髓样本，分析供体细胞在小鼠体内的表达。
　　 结果：成功重组了p-SFFV慢病毒载体并使其在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4％）；骨髓移植实验表明携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（骨髓移植16周后骨髓单个核细胞感染效率92%）。
　　 结论：shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。
　　 第三部分：通过shRNA慢病毒载体库体外筛选干细胞衰老相关功能基因
　　 目的：扩增包含靶向人类1000个衰老相关基因对应的2400个shRNA克隆的慢病毒载体库，将其导入可被Dox诱导发生二次重编程的iPS嵌合体小鼠皮肤成纤维细胞培养体系中，观察iPS克隆形成的效率。
　　 方法：将所选的慢病毒载体库随机分配到三个组合中，制备转化效率较高的超级感受态细菌，检测转化效率并扩增慢病毒载体库；分离并培养可被Dox诱导发生二次重编程的iPS嵌合体小鼠原代皮肤成纤维细胞；通过293T包装细胞包装成熟慢病毒颗粒，体外感染细胞后加入Dox连续诱导21天，使其去分化形成iPS克隆。利用SSEA-1荧光抗体表面标记iPS细胞，流式细胞仪分选后提取细胞DNA，进行深度测序，初步筛选目的基因。
　　 结果：成功制备转化效率较高的超级感受态细胞，分离并体外培养了可被Dox诱导发生二次重编程的iPS嵌合体小鼠原代皮肤成纤维细胞；形成iPS克隆后流式细胞仪分选SSEA-1阳性、GFP阳性和SSEA-1/GFP双阳性的细胞群，提取细胞DNA后进行深度测序。
　　 结论：通过shRNA慢病毒载体库体外感染iPS嵌合体小鼠皮肤成纤维细胞，诱导其发生二次重编程形成iPS克隆，并成功分选出SSEA-1阳性、GFP阳性和SSEA-1/GFP双阳性的细胞群。