钠钙交换体NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5亚型高表达细胞株的建立及生理、病理功能研究

摘要

钠钙交换体(NCX)是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种双向转运体，几乎所有细胞均有NCX蛋白表达。生理情况下，NCX参与心肌细胞兴奋收缩耦联过程，参与神经元中神经递质的释放，而在所有细胞中，NCX参与细胞内钙离子稳态的调节。与此同时，NCX还可能进行反向转运参与众多疾病的发生发展过程。因此，NCX具有极其重要的生理病理意义。目前，关于NCX活性调节和病理功能的研究甚多，但是关于蛋白磷酸化对NCX1活性的调节，以及在缺血相关病理过程中NCX1的功能方面，人们所得到的结论并不完全一致，仍存在相互矛盾之处。因此，本实验采用脂质体转染的方法将心脏型NCX1.1、大脑型NCX1.4和NCX1.5三种基因稳定导入CHO细胞中，建立特异性表达NCX1.1、NCXl.4和NCX1.5三种亚型的细胞模型，以期研究蛋白激酶对不同组织来源的NCX1剪接产物的影响，同时探讨NCX1在缺血相关病理过程中的功能及筛选可能的NCX调节剂。
　　 第一部分:
　　 NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5稳定转染细胞株的构建
　　 我们首先利用酶切法对pcDNA3.1+质粒载体上插入的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5基因的条带大小进行鉴定。结果显示NCX基因插入位点准确，条带数目与大小符合理论值。此外，我们还将上述质粒送交至Invitrogen和Takara公司进行测序，结果发现插入的NCX基因与GenBank中该基因目的序列完全一致。
　　 随后，我们采用脂质体转染法将大鼠心脏NCX1.1、大鼠大脑NCX1.4及NCX1.5基因稳定整合到CHO细胞内，用G418处理2-3周并筛选出单个克隆的高表达细胞株。经鉴定，在野生型CHO-K1细胞中未检测到有NCX蛋白的表达，而在3种稳定转染的NCX细胞中大量表达有NCX蛋白，且表达水平相似。采用改变细胞内外环境中Na+浓度的方法，用第二代钙荧光指示剂Fura-2作为Ca2+探针，我们对上述细胞内表达的NCX蛋白的生物活性进行了评估。结果显示，用等摩尔NMDG+替换外液中的NaCl后，野生型CHO细胞的[Ca2+]i几乎没有改变，而3种CHO-NCX细胞的[Ca2+]i均显著升高，提示去除细胞外钠离子可以激活NCX反向转运，进而说明细胞中表达的NCX蛋白具有生物学功能。
　　 异硫脲衍生物KB-R7943是迄今发现的对NCX抑制作用较为特异的一种化合物，现已作为药理学工具药被广泛用来研究生理病理状态下NCX的作用。在本部分试验中，我们进一步观察了不同浓度的NCX抑制剂KB-R7943对上述3种稳定转染的NCX细胞中NCX电流(INCX)的影响。结果显示KB-R7943对3种NCXI选择性剪接产物NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5的内外向电流均具有抑制作用，且呈现一定的剂量依赖性，但缺乏亚型选择性。
　　 本部分研究提示稳定表达有大鼠心脏型NCX1.1、大鼠大脑型NCX1.4和NCX1.5三种亚型的细胞株构建成功，为下一步对心脏和脑中的NCX1剪接产物的生理调节及病理功能的研究提供了良好的平台。
　　 第二部分:
　　 蛋白磷酸化对NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5反向转运活性的影响
　　 参与NCX活性调节的因素很多，如今研究已发现的包括单价、二价和三价阳离子，神经递质，激素和肽类物质等。在众多因素当中，蛋白磷酸化与NCX活性之间的相互关系依然没有定论。为了单独研究蛋白磷酸化对NCX功能的影响，我们采用稳定转染单一NCX亚型的CHO细胞作为平台，观察蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)对NCX反向转运活性的影响。
　　 在本部分研究中，我们首先评价了PKC激动剂Phorbol12-myristate13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型CHO细胞和稳定转染的NCX细胞中NCX反向转运活性的影响。结果提示，在无Na+环境下，PKC激动剂PMA对野生型CHO细胞中[Ca2+]i无明显影响。但是，心脏型NCX1.1的反向转运却可以为PKC激动剂PMA强烈激活，从而引起细胞内出现大幅度的钙瞬变,3μM时激动作用达到最大，此时[Ca2+]i上升速率为23.82nM/sec，较对照组具有显著升高。NCX抑制剂KB-R7943预孵育可以有效阻断这种激动作用，从而说明细胞内[Ca2+]i的升高确实经由NCX介导。此外，Ca2+螯合剂EGTA可以有效消除稳定转染的NCX1.1细胞中的钙瞬变现象，该结果提示NCX介导的胞内[Ca2+]i的升高与细胞外液中的Ca2+直接相关。虽然PKC激动剂PMA对大脑型NCX1.4和NCX1.5也具有一定的激动作用，但脑源性的NCX亚型对于PMA的敏感性较心脏型NCX1.1显著降低，两者相差达10倍以上。其中，仅10μMPMA对NCX1.5细胞反向转运具有显著激动作用，其[Ca2+]i上升速率较对照组细胞具有显著升高。
　　 此外，我们还观察了PKA激动剂8-Bromoadenosine3’,5’-cyclicmomophoshate(8-BrcAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型CHO细胞和稳定转染的NCX细胞中NCX反向转运活性的影响。结果提示，在无Na+环境下，PKA激动剂8-BrcAMP对野生型CHO细胞中[Ca2+]i不具有显著的影响。但是，心脏型NCX1.1的反向转运却可以为PKA激动剂8-BrcAMP强烈激活，从而引起细胞内出现大幅度的钙振荡现象。NCX抑制剂KB-R7943预孵育可以有效阻断这种激动作用，从而说明细胞内[Ca2+]i的升高确实经由NCX介导。此外，Ca2+螯合剂EGTA可以有效消除稳定转染的NCX1.1细胞中的钙振荡现象，该结果提示NCX介导的胞内[Ca2+]i的升高与细胞外液中的Ca2+直接相关。PKA激动剂8-BrcAMP对大脑型NCX1.4和NCX1.5的激动作用与心脏型NCX1.1类似，低浓度(10μM)的8-BrcAMP即可以引起上述细胞胞内出现显著的钙振荡。
　　 本部分研究提示PKC和PKA均参与了心脏型NCX1.1、大脑型NCX1.4和NCX1.5的反向转运活性的调节，不同的是，大脑型NCX1.4和NCX1.5对PKC激动剂PMA的敏感性较心脏型NCX1.1低10倍以上，从而提示PKC蛋白磷酸化对不同组织来源的NCX1剪接产物的调节作用程度不一。
　　 第三部分:
　　 NCX在缺血相关病理模型中作用的研究
　　 1．H2O2损伤模型中NCX作用的研究
　　 我们首先评价了H2O2损伤对野生型和转基因细胞生存率的影响。利用MTT方法，我们发现H2O2损伤24小时可以引起野生型和转基因细胞的细胞生存率出现浓度依赖性的下降，其中70μMH2O2损伤24小时后，NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为45.1％和44.0%，较野生型细胞75.3%的存活显著降低。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡，结果显示转基因细胞在70μMH2O2损伤24小时后，稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为32.7%、49.5%和52.7%，与野生型CHO细胞24.2%的死亡率相比，稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显著性的升高。随后，我们还采用钙成像技术实时监测H2O2损伤后各组细胞胞内[Ca2+]i的动态变化过程，结果显示，野生型CHO细胞胞内的[Ca2+]i升高幅度较低，上升速率较慢。本部分研究提示在氧化损伤模型中，氧自由基可以导致细胞内钙外排系统紊乱，细胞胞内[Ca2+]i升高，而H2O2还可以进一步激活NCX反向转运，加剧细胞损伤。
　　 2．酸中毒模型中NCX作用的研究
　　 类似的，我们首先评价了中度酸中毒损伤(pH6.4)对野生型和转基因细胞生存率的影响。利用MTT方法，我们发现pH6.4的细胞外液损伤可以引起野生型和转基因细胞的细胞生存率出现时间依赖性的下降，其中pH6.4的细胞外液损伤24小时后，NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为55.2%、62.5%和61.3%，较野生型细胞48.2%的存活显著升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡，结果显示转基因细胞在pH6.4的细胞外液损伤24小时后，稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为20.7%、22.7%和23.2%，与野生型CHO细胞33.3%的死亡率相比，稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显著性的降低。随后，我们还采用钙成像技术实时监测各组细胞在pH6.4的环境下其胞内[Ca2+]i的动态变化过程，结果显示，野生型CHO细胞胞内的[Ca2+]i随酸化时间的延长而逐渐升高，而NCX转染细胞胞内[Ca2+]j轻微下降或者基本维持不变。本部分研究提示在酸中毒损伤模型中，由于未去除细胞外液中的葡萄糖，因而细胞的能量供应正常，NCX可以以正向转运的方式排出细胞内的钙离子，从而发挥细胞保护作用。
　　 3．Ca2+paradox模型中NCX作用的研究
　　 我们首先采用无钙细胞外液孵育野生型和转基因细胞1小时，然后复灌标准细胞外液、中钙(2.5mM)及高钙(3.8mM)三种不同钙离子浓度的细胞外液，孵育不同时间后评价钙反常损伤对野生型和转基因细胞生存率的影响。
　　 利用MTT方法，我们发现复灌标准细胞外液、中钙(2.5mM)及高钙(3.8mM)三种不同钙离子浓度的细胞外液构建钙反常损伤时，野生型和转基因细胞的生存率均出现时间依赖性的下降。
　　 复灌标准细胞外液24小时后，NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为79.2%、80.3%和81.6%，较野生型细胞64.7%的存活显著升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡，结果显示转基因细胞在复灌标准细胞外液24小时后，稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为19.4%、25.4%和21.4%，与野生型CHO细胞29.g%的死亡率相比，稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显著性的降低。
　　 复灌含有2.5mM钙离子的细胞外液24小时后，NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为83.0%、83.3%和80.9%，较野生型细胞68.0%的存活显著升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡，结果显示转基因细胞在复灌含有2.5mM钙离子的细胞外液24小时后，稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为23.2%、28.6%和23.8%，与野生型CHO细胞29.4%的死亡率相比，稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显著性的降低。
　　 复灌含有3.8mM钙离子的细胞外液24小时后，NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为77.4%、75.2%和73.2%，较野生型细胞54.90%的存活显著升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡，结果显示转基因细胞在复灌含有3.8mM钙离子的细胞外液24小时后，稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为31.2%、35.8%和32.8%，与野生型CHO细胞51.3%的死亡率相比．稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显著性的降低。
　　 随后，我们还采用钙成像技术实时监测各组细胞在Ca2+paradox过程中胞内[Ca2+]i的动态变化过程，结果显示，灌流无钙液后，野生型细胞内[Ca2+]i未见显著改变，而稳定转染的NCX细胞[Ca2+]i出现虽然轻微，但是却具有显著性的降低，这种胞内[Ca2+]i的降低主要由NCX正向转运介导。有钙液复灌1小时后野生型CHO细胞胞内的[Ca2十]i随时间延长而逐渐升高，而NCX转染细胞胞内[Ca2+]i出现较为恒定的平台期。本部分研究提示在钙反常模型中，复灌有钙液可以导致细胞内[Ca2+]i急剧上升，从而激活NCX正向转运，其通过降低胞内的钙离子浓度而发挥细胞保护作用。
　　 在本部分研究中，我们以稳定转染NCX基因的细胞株作为平台，从氧化应激损伤，酸中毒损伤和钙超载损伤既相互关联却又不完全相同的三个方面模拟缺血相关病理过程，观察心脏型NCX1.1以及大脑型NCX1.4和NCX1.5在上述疾病模型中所发挥的功能。该部分结果提示，NCX在不同的损伤环境中具有不同的转运方式，从而发挥细胞保护或者起到加重损伤的作用。
　　 钠钙交换体(NCX)是细胞膜上的一种双向转运体。在正常生理条件下，NCX主要以正向转运的方式将细胞内的钙离子转运到细胞外。在某些病理条件下，NCX可以进行反向转运，介导钙离子内流。脑缺血时，细胞内的钠、钙离子稳态失衡可以激活NCX，因此人们采用了一系列体外和体内试验对缺血神经元中NCX的作用进行了研究。体外缺血相关模型常见的有低氧/缺氧和谷氨酸损伤，在上述模型中，人们常常得到不完全一致的结果，一部分研究显示NCX具有神经保护作用而另一部分则提示NCX能加重神经元损伤。体内试验多采用局灶性脑缺血模型，在该模型中的大部分研究结果显示阻断NCX活性能加重神经元损伤，而激活NCX可以起到神经保护作用。本文对一系列脑缺血相关的体内和体外研究进行了总结，以期试图分析引起研究结果相互矛盾的原因。其可能与缺血模型不一和NCX抑制剂或激动剂特异性不高有关。NCX转基因动物的问世有助于了解NCX在缺血神经元中的作用。

目录

英文缩略词表

摘要

第一部分 NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5稳定转染细胞株的构建

前言

材料与方法

结果

1.NCX质粒鉴定

2.NCX蛋白表达

3.NCX蛋白功能检测

4.NCX抑制剂KB-R7943对INcx的影响

小结

第二部分 蛋白磷酸化对NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5反向转运活性的影响

前言

第一节 PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型和稳定转染的CHO细胞中NCX反向转运活性的影响

材料和方法

结果

小结

第二节 PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型和稳定转染的CHO细胞中NCX反向转运活性的影响

材料与方法

结果

小结

第二部分 小结

第三部分 NCX在缺血相关病理模型中作用的研究

前言

第一节 H2O2损伤模型中NCX作用的研究

材料和方法

结果

小结

第二节 酸中毒损伤模型中NCX作用的研究

材料和方法

结果

小结

第三节 钙反常(Ca2+Paradox)损伤模型中NCX作用的研究

材料和方法

结果

小结

第三部分 小结

全文讨论

全文总结

参考文献

附录一

附录二

综述

个人简历

在校期问发表文章和参加学术会议情况

致谢

声明