NCX1.1基因编码钠钙交换体电流特征及起搏特性的研究

摘要

目的：
　　钠钙交换体（sodium–calcium exchanger)是广泛分布于心肌细胞膜上的一种膜转运蛋白。部分实验在哺乳动物心脏中发现β-肾上腺受体激动剂能加强钠钙交换体的功能，钠钙交换体电流是起搏电流产生和维持的一个重要组成，目前对于异丙肾上腺素是如何影响到乳鼠窦房结细胞钠钙交换体活动的研究较少，对于信号作用通路的争议一直存在。实验通过比较乳鼠窦房结细胞与NCX1.1质粒转染人胚肾细胞（293细胞）的INCX的电生理特性，研究β受体对INCX调控及可能的信号转导途径，进一步明确INCX的在起搏电流中的作用。
　　第一部分乳鼠窦房结细胞INCX电流特征
　　方法：
　　分离和培养乳鼠窦房结细胞，运用全细胞膜片钳技术测定INCX的I-V曲线、刺激频率依赖性的差异I-V曲线、异丙肾上腺素对INCX刺激作用及cAMP合成激动剂Forskolin、Gi蛋白抑制剂百日咳毒素、PKA抑制剂H89对INCX的作用I-V曲线。
　　结果：
　　乳鼠窦房结细胞分离培养后镜下观察，梭形细胞比例最高，梭形细胞搏动频率为147.9±9.9次/min，采用电流钳模式记录梭形细胞动作电位，在无任何电流刺激下，培养的梭形细胞均可记录到自发性动作电位。记录INCX通道电流，各个刺激频率下INCX电流密度无明显差异，异丙肾上腺素可使INCX密度增高36.7％，异丙肾上腺素0.1μmol、1μmol、10μmol与可使INCX密度增高36.7%、111%、169%，Forskolin可使INCX密度增高41.27%，PTX可使INCX密度增高12.8%，H89可抑制异丙肾上腺素对INCX刺激作用使INCX密度减低28.11%(P均＜0.05)。
　　结论：
　　1.INCX对频率刺激不具有依赖性。
　　2.异丙肾上腺素对钠钙交换体具有激发作用。
　　3.钠钙交换电流对异丙肾上腺素呈现剂量依赖性。
　　4.β受体激动可能通过刺激型Gs蛋白/Gi蛋白-cAMP-PK A途径参与调节INCX。
　　第二部分NCX1.1编码的INCX电流特征
　　方法：
　　利用免疫磁珠阳性标记表达系统记录NCX1.1编码的 INCX电流，改变胞内Na+浓度、记录加入β受体激动剂异丙肾上腺素、cAMP合成激动剂Forskolin（2μmol/L）、Gi蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX，2μg/ml)、PKA抑制剂H89(10μmol/L)，对INCX的影响作用，研究INCX特性。
　　结果：
　　记录INCX通道电流，加大细胞内液中Na+浓度33.3%可使内向INCX密度减低28.75%，减小细胞内液中Na+浓度33.3%可使内向INCX密度增加33.91%，异丙肾上腺素（ISO）可使内向INCX密度增高27.67%，Forskolin可使内向INCX密度增高81.25%，PTX可使异丙肾上腺素作用下的内向INCX密度增高26.32%，H89可抑制异丙肾上腺素对INCX刺激作用使异丙肾上腺素素对INCX加大作用减低35.58%(P均＜0.05)。
　　结论：
　　1.NCX1.1编码的细胞钠钙交换体正向转运对胞内Na+浓度的反应敏感，然而Na+浓度的改变对反向转运模式未发现明显作用。
　　2.异丙肾上腺素可以激活NCX1.1编码的INCX电流正向装运模式，而对INCX反向转运模式无明显作用。
　　3.β受体激动可能通过刺激型Gs蛋白/Gi蛋白-cAMP-PKA途径参与调节INCX。

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第一部分 乳鼠窦房结细胞INC X电流特征

一、材料与方法：

1. 试剂与溶液：

2. 实验动物

3. 大鼠乳鼠窦房结细胞的急性分离与培养

4. 膜片钳的形成及刺激参数的设置

5. 乳鼠窦房结钠钙电生理特性的测定及比较

6. 数据处理

二、结果：

1. “酶解+差速贴壁”分离和培养乳鼠窦房结细胞方法研究

2．乳鼠窦房结细胞钠钙交换体电流特征

3 β-受体对大鼠心肌细胞INCX调控的信号转导途径的研究

四、结论：

五、讨论：

第二部分 NCX1.1编码的INCX电流特征

一、材料与方法：

1. 试剂与溶液：

2. HEK-293细胞培养：

3.质粒的来源

4.质粒的瞬时转染

5. 膜片钳形成及参数

6. 钠钙交换体电生理特性的测定

7. 数据处理

二、结 果：

1.NCX1.1基因共转染HEK-293E细胞的方法研究

2. NCX1.1编码的INCX电生理特征

3 β-受体对NCX1.1编码的INCX调控的信号转导途径的研究

四、结论：

五、讨论：

参考文献

致谢

综述：

参考文献