α7nAChR激动剂后处理对大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及机制的实验研究

摘要

众多动物实验表明,在急性心肌缺血所致的最终心肌梗死面积中,大约50％是由缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)所引起。虽然缺血预处理(ischemicprecondition)是目前已知的最强大的心肌保护干预措施,但是由于其需要在心肌缺血发生前实施干预,显然这在急性心肌梗死的情况下是不可能的,所以其临床应用受到了极大的限制。虽然缺血后处理(ischemic postconditioning)成功地解决了缺血预处理所存在的干预时机选择问题,但是由于其与缺血预处理一样仍然依赖于有创操作,所以其仅可应用于接受冠状动脉介入治疗的患者或针对急性心肌缺血而实施的某些心脏手术中。另外,缺血后处理这一有创性操作本身也并非适用于所有的患者,并有导致病变冠状动脉破裂或粥样硬化斑块脱落等其他并发症的高风险。鉴于缺血预处理和缺血后处理的局限性,就临床应用而言,在心肌缺血发生后进行药物治疗以获得有效的心肌保护作用,即“药物后处理”(pharmacologicalpostconditioning)则具有更大的临床实际意义。目前,药物预处理和药物后处理均已成为缺血预处理或缺血后处理的有效替代途径。药物后处理的主要优点是临床应用不受心肌缺血时间的限制、方法简便、不需要有创操作和费用低廉等。
　　 心肌缺血-再灌注损伤实际上是一种炎症反应,主要表现为炎症细胞局部侵润和炎症细胞因子大量产生和释放。晚近研究发现,胆碱能抗炎通路通过迷走神经作用于α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholiner receptor,α7nAChR)能够抑制炎症细胞因子的产生和释放,恢复炎症反应平衡,并保护机体。研究证实,迷走神经刺激可降低炎症反应时肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisi factorα,TNF-α)、白介素6(interleukin6,IL-6)和高迁移率组蛋白1(high mobilit),group box1,HMGB1)等炎症细胞因子的组织和循环血液水平,而且迷走神经刺激亦可保护缺血-再灌注所致的心肌损伤。由于应用α7nAChR激动剂能够产生与迷走神经刺激相同的效应,所以作为无创、操作简单的一种药物后处理,α7nAChR激动剂可能具有潜在的临床应用前景。虽然目前已有研究证实α7nAChR激动剂对肾脏缺血-再灌注损伤具有保护作用,但是α7nAChR激动剂对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用尚未得到充分研究。
　　 联合不同干预措施以获得更好的心肌保护效果一直是心肌缺血-再灌注损伤领域重要的研究方向之一,而缺血后处理和α7nAChR激动剂后处理这两种具有临床应用价值的心肌保护干预措施的触发机制明显不同。有鉴于此,我们设计了这个随机对照实验,旨在观察缺血后处理和α7nAChR激动剂后处理的心肌保护效果,并试图证实联合应用两者是否能够获得协同性心肌保护作用。另外,本实验还试图确定α7nAChR激动剂后处理的最佳干预时间,并研究P13K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用缺血后处理和α7nAChR激动剂后处理心肌保护作用中的地位,以探讨其相互作用的内在机制。本实验共分为三部分:
　　 第1部分:PNu282987后处理和缺血后处理对在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤及其炎症反应影响的实验研究
　　 第1部分实验的目的是采用大鼠在体心肌缺血.再灌注损伤模型比较性观察PNU282987后处理和缺血后处理的心肌保护效应,并验证两种干预措施在降低心肌梗死面积方面是否存在有协同性作用。
　　 将60只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(体重290-320g)麻醉后随机分为六组:空白对照组(S组,n=10)；对照组(C组,n=10)；缺血预处理组(IPC组,n=10)；缺血后处理组(IPOC组,n=10)；PNU282987后处理组(P组,n=10)和联合应用PNU282987后处理和缺血后处理组(PPOC组,n=10)。所有大鼠开胸后采用丝线将其冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)套扎做成活结。除S组之外,所用大鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻断LAD)和再灌注180 min(开放LAD)的处理。C组不采用任何干预措施；IPC组在结扎LAD前进行3个循环的缺血预处理,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30 min；IPOC组在再灌注前进行3个循环的缺血后处理,每个循环是由10s的LAD开放和10s的LAD阻断组成,总处理的时间是1min；S组、C组、IPC组和IPOC组大鼠均在30 min缺血后腹腔注射生理盐水1.5ml。P组于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg；PPOC组的处理同IPOC组,并于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg。实验过程中,连续监测心率(heart rate,HR)、平均动脉压(meanarterial presure,MAP)和Ⅱ导联心电图(ECG),并保持大鼠直肠温度在36.5～37.5℃之间。在再灌注30 min和180 min时抽取血标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac Trooonin-Ⅰ,cTnⅠ)、TNF-α、IL-6和HMGB1浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测心肌梗死面积(infarct size,IS％)。
　　 结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。
　　 再灌注期间S组的心率血压乘积(rate-pressure product,RPP)显著高于C组。C组的MAP显著低于S组、IPC组、IPOC组、P组和PPOC组。与IPC组相比,C组、IPOC组、P组和PPOC组缺血期发生室性心律失常的大鼠数目显著增多,并且缺血期室性心律失常评分显著增高。与C组相比,IPOC组和PPOC组再灌注初期发生室性心律失常的大鼠数目显著减少,并且再灌注初期室性心律失常评分也显著降低。
　　 与C组相比,IPC组、IPOC组、P组和PPOC组的IS％和血清cTnI浓度均显著降低；与IPC组相比,PPOC组的IS％无显著统计学差异,虽然IPOC组和P组的IS％显著增高,但P和PPOC组的TnI血清浓度显著降低；与IPOC组相比,P组的IS％无显著统计学差异,但PPOC组的IS％显著降低,并且P组和PPOC组的TnI显著降低。析因分析结果显示,PNU282987后处理和缺血后处理在降低IS％方面无交互作用。
　　 与S组相比,C组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度显著增高,再灌注180 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度也显著增高。与C组相比,IPC组、IPOC组、P组和PPOC组再灌注180 min时血清TNF-α和HMGB1浓度均显著降低；除IPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度显著增高之外,IPC组、P组和PPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度均显著降低；并且P组和PPOC组再灌注180 min时的血清IL-6浓度也显著降低,而IPOC组再灌注180 min时血清IL-6浓度显著增高。与IPC组相比,IPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度显著增高,再灌注180 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度显著增高；P组再灌注30 min时血清TNF-α浓度以及再灌注180 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度显著降低,但是再灌注30 min时IL-6血清浓度显著增高；PPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度以及再灌注180 rain时血清IL-6和HMGB1浓度显著降低。与IPOC组相比,P组和IPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度以及再灌注180 min时的血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度也显著降低。
　　 第2部分:PNU282987后处理减轻大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤最佳干预时间的实验研究
　　 根据第1部分的研究结果,我们设计了这部分实验,其目的是探讨在心肌缺血再灌注过程中何时实施PNU282987后处理能够获得最佳的心肌保护效应,以确定PNU282987后处理的最佳干预时间。
　　 将70只成年雄性SD大鼠(体重290～320g)麻醉后随机分为七组:空白对照组(S组,n=10)；对照组(C组,n=10):缺血预处理组(IPC组,n=10):PNU282987后处理组(P组,n=10)；再灌注30 min时PNU282987后处理组(P30组,n=10)；再灌注60 min时PNU282987后处理组(P60组,n=10)和再灌注90 min时PNU282987后处理组(P90组,n=10)。C组、IPC组和P组的处理同第1部分实验,P30组、P60组和P90组的基本处理与C组相同,但分别在再灌注30 min、60min和90 min时腹腔注射PNU2829872.4mg/kg实施药物后处理。各项检测项目同实验第一部分。但仅在再灌注180 min时采血检测血清炎症细胞因子浓度。
　　 结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。再灌注期,C组的MAP显著低于S组、IPC组、P组、P30组和P60组。心肌缺血期,IPC组发生室性心律失常的大鼠数目较C组、P组、P30组、P60组和P90组显著减少,并且室性心律失常评分显著降低。与IPC组相比,C组、P30组、P60组和P90组再灌注初期室性心律失常评分显著增高。
　　 与C组相比,IPC组、P组、P30组、P60组和P90组再灌注180 min时的血清cTnI浓度和IS％值均显著降低。与IPC组相比,P组、P30组、P60组和P90组再灌注180 min时的血清cTnI浓度均显著降低,但是P组、P30组、P60组和P90组的IS％值显著增高。与P30组相比,P90组的IS％值显著增高。
　　 与S组相比,再灌注180 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在C组显著增高。与C组相比,再灌注180 min时血清TNF-α和HMGB1浓度在IPC组、P组、P30组、P60组和P90组显著降低,并且再灌注180 min时血清IL-6浓度在P组、P30组、P60组和P90组显著降低。与IPC组相比,再灌注180 min时血清IL-6和HMGB1浓度在P组、P30组、P60组和P90组显著降低,再灌注180 min时血清TNF-α浓度在P组显著降低,但再灌注180min时血清TNF-α浓度在P30和P60组显著增高。与P组相比,P30组、P60组和P90组再灌注180 min时血清TNF-α和HMGB1浓度显著增高,但再灌注180 min时血清IL-6浓度显著降低。与P30组相比,P60组和P90组再灌注180 min时血清TNF-α和HMGB1浓度显著降低,但再灌注180 min时血清IL-6浓度显著增高。
　　 第3部分P13K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用PNU282987后处理和缺血后处理心肌保护作用机制中地位的研究
　　 本部分实验的目的是探讨PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用PNU282987后处理和缺血后处理心肌保护作用机制中的地位。
　　 25只成年雄性SD大鼠(体重290-320g)麻醉后随机分为五组:对照组(C组,n=5)；缺血预处理组(IPC组,n=5)；缺血后处理组(IPOC组,n=5)；PNU282987后处理组(P组,n=5)、联合应用PNU282987后处理和缺血后处理组(PPOC组,n=5)。在开放LAD实施再灌注60 min时结束实验,取大鼠左心室缺血区心肌标本。由心肌标本中提取总蛋白和总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(Real-timequantitative polymerase chain reaction,RQ-PCR)技术观察Akt和STAT3基因在心肌组织的表达情况,并通过免疫蛋白印迹分析(Western-blotting)技术观察心肌组织Akt和STAT3蛋白磷酸化情况。
　　 Western—blotting结果显示,与C组相比,IPC组的p-Akt显著增强,同时IPOC组的p-Akt和p-STAT3显著增强。与IPC组相比,P组的p-Akt和p-STAT3显著减弱,同时PPOC组的p-STAT3也显著减弱。与IPOC组相比,P组的p-Akt和p-STAT3显著减弱,PPOC组的p-STAT3也显著减弱。RQ-PCR结果显示,IPC组STAT3基因表达较C组和P组显著增强,而且IPOC组的Akt基因表达较PPOC组显著增强。
　　 结论:
　　 通过本实验,我们得出以下结论:
　　 1.PNU282987后处理和缺血后处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用不尽相同。在减小心肌梗死面积方面两者的作用基本相同,但缺血后处理可显著抑制再灌注初期室性心律失常的发生,而PNU282987后处理对再灌注初期室性心律失常则无明显抑制作用。
　　 2.联合应用PNU282987后处理和缺血后处理能够获得增强的心肌保护作用,并且联合应用两种干预措施亦可弥补PNU282987后处理不能抑制再灌注初期室性心律失常的缺点。
　　 3.缺血预处理、PNU282987后处理、缺血后处理以及联合应用PNU282987后处理和缺血后处理均可明显抑制心肌缺血.再灌注过程中的炎症反应,并且是以联合应用PNU282987后处理和缺血后处理时的炎症反应抑制作用最强。但是,缺血预处理、PNU282987后处理和缺血后处理的炎症抑制作用在方式和强度方面存在有一定的差异。
　　 4.再灌注30 min时实施PNU282987后处理的心肌保护效果最佳。
　　 5.缺血预处理和缺血后处理的心肌保护作用涉及P13K/Akt和JAK/STAT信号转导通路激活,并且这两个信号转导通路也参与PNU282987后处理以及联合应用PNU282987后处理和缺血后处理的心肌保护作用,但不是主要机制。PNU282987的心肌保护作用机制可能与缺血预处理和缺血后处理不同。